Padronização de um teste de diagnóstico para Estomatite Vesicular por PCR em tempo real

• Autor(a) principal: Pedro Augusto Alves
• Data de Publicação: 2010
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da UFMG
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/1843/ICBD-8F8QSG
• topic: Vírus da estomatite vesicular; PCR em tempo real; Estomatite vesicular; Microbiologia

A estomatite vesicular foi primeiramente descrita nos Estados Unidos em 1926 como uma doença vesicular de equinos e, subsequentemente de bovinos e suínos. A doença se caracteriza pela formação de vesículas principalmente na língua, lábios, mucosa oral, tetas e na banda coronária das patas desses animais. O vírus da estomatite vesicular, agente causador da doença, é um vírus de RNA senso negativo e envelopado que pertence ao gênero Vesiculovirus, da família Rhabdoviridae. A estomatite vesicular é clinicamante indistinguível de outras doenças vesiculares, como a febre aftosa, o exantema vesicular dos suínos e a doença vesicular dos suínos, quando equinos não estão envolvidos. Isso traz grandes implicações sócio-econômicas e, na falta de um diagnóstico clínico, o diagnóstico laboratorial torna-se urgente e imprescindível em caso de suspeita de estomatite vesicular. Neste trabalho, o material genético de uma amostra protótipo de VSV foi utilizado como molde em PCR convencional para obtenção de um plasmídio controle positivo da reação. A amostra protótipo foi caracterizada a partir do sequenciamento do plasmídio com o inserto de VSV. Para a qPCR, foram desenhados os iniciadores, em uma região conservada do gene L (RNA polimerase viral), a partir de sequências da amostra protótipo (VSIV) e de amostras de campo (VSAV e COCV). A padronização da reação com plasmídio controle foi feita com mix caseiro, sendo que a concentração final de cada iniciador foi de 1,25 mol/100L, com 10 M de dNTP e 2,0 mM de MgCl2. Os corantes utilizados foram o Evagreen para o sistema de detecção e o ROX® como referência passiva. A reação foi otimizada para aumentar a sensibilidade e os parâmetros finais foram os seguintes: 4,0 mol/100L de cada iniciador, 100 M de dNTP e 2,0 mM de MgCl2. Foram escolhidos os genes de -actina e HPRT bovinos para serem utilizados como normalizadores da reação. O teste apresentou resultados satisfatórios quando utilizado o mix comercial, mas com necessidade de aprimoramentos principalmente com relação aos iniciadores para ser utilizado no diagnóstico da estomatite vesicular bovina.