Caracterização e purificação da toxina killer produzida pela levedura Kodamaea ohmeri ES92

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Main Author: Marina Lages de Andrade
Publication Date: 2011
Format: Master thesis
Language: por
Source: Repositório Institucional da UFMG
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Summary: As toxinas killer ou micocinas, produzidas por leveduras, são moléculas extracelulares que exercem efeito deletério em células susceptíveis da mesma espécie, ou de espécies distintas, sem que ocorra o contato entre as células. A levedura Kodamaea ohmeri, alvo deste estudo, foi isolada do cactos Opuntia sp. e foi preliminarmente caracterizada como produtora de toxina killer. Sua micocina tem efeito deletério em espécies do gênero Candida, relevantes agentes oportunistas, cuja importância médica vem crescendo com o aumentode pacientes imunossuprimidos ou com outras condições predisponentes. Torna-se necessária a busca por novas drogas antifúngicas já que estes microrganismos estão relacionados com altas taxas de morbidade e mortalidade, além de algumas linhagens serem pouco suscetíveis às drogas antifúngicas tradicionais. Surge então, a importância de estudar a micocina de K. ohmeri que ainda não foi caracterizada. Neste estudo objetivou-se determinar o espectro de ação da micocina bem como obter sua caracterização, purificação e identificação. Para determinar o espectro de ação da toxina foram utilizadas linhagens pertencentes a diferentes espécies do gênero Candida, linhagens de Saccharomyces cerevisiae, Kodamaea ohmeri ediferentes espécies de dermatófitos. Ao longo dos experimentos surgiu a necessidade de confirmar a identidade de algumas das amostras de Candida utilizadas, previamente identificadas pelo kit de fermentação API20AUX (Biomerrieux), empregando-se para tal o crescimento em CHROMagar e o seqüenciamento de DNA ribossomal. A identificação de Candida por CRHOMagar foi mais precisa que aquela feita pelo kit de fermentação API20AUX, considerando-se sua destinação precípua para as espécies C. albicans, C. krusei e C. parapsilopsis, tendo sido muito coerente com as identificações obtidas com base no seqüenciamento. A caracterização da micocina baseou-se na avaliação da sua resistência à variações de temperatura, pH, presença de diferentes íons, definição de sua natureza, determinação de sua massa e investigação de seu determinante genético. Na tentativa de purificar e identificar a toxina, foram utilizadas as técnicas de cromatografia liquida (HPLC), eletroforese (SDS-PAGE) e espectrometria de massa (MS). As linhagens de C. albicans (86,2%) e C. glabrata (60%) foram as mais sensíveis à micocina, seguidas pelas amostras de S. cerevisiae (50%) e por outras linhagens de K. ohmeri (50%); os dermatófitos testados foramresistentes. Os resultados indicam que a sensibilidade das amostras de C. albicans à micocina pode ter importância taxonômica, uma vez que foram substancialmente mais sensíveis que as demais espécies. Os resultados obtidos indicam que a micocina de K. ohmeri seja uma glicoproteína que possui massa acima de 30 kDa, sensível a temperaturas maiores ou iguais a 37°C, mais ativa entre pH 3,5 a 4,5; possui atividade antifúngica aumentada na presença de íons de cálcio e é possivelmente codificada por um gene plasmidial. Os testes realizados não indicaram que a micocina provoque morte celular por formação de poro na membrana celular.
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Torna-se necessária a busca por novas drogas antifúngicas já que estes microrganismos estão relacionados com altas taxas de morbidade e mortalidade, além de algumas linhagens serem pouco suscetíveis às drogas antifúngicas tradicionais. Surge então, a importância de estudar a micocina de K. ohmeri que ainda não foi caracterizada. Neste estudo objetivou-se determinar o espectro de ação da micocina bem como obter sua caracterização, purificação e identificação. Para determinar o espectro de ação da toxina foram utilizadas linhagens pertencentes a diferentes espécies do gênero Candida, linhagens de Saccharomyces cerevisiae, Kodamaea ohmeri ediferentes espécies de dermatófitos. Ao longo dos experimentos surgiu a necessidade de confirmar a identidade de algumas das amostras de Candida utilizadas, previamente identificadas pelo kit de fermentação API20AUX (Biomerrieux), empregando-se para tal o crescimento em CHROMagar e o seqüenciamento de DNA ribossomal. A identificação de Candida por CRHOMagar foi mais precisa que aquela feita pelo kit de fermentação API20AUX, considerando-se sua destinação precípua para as espécies C. albicans, C. krusei e C. parapsilopsis, tendo sido muito coerente com as identificações obtidas com base no seqüenciamento. A caracterização da micocina baseou-se na avaliação da sua resistência à variações de temperatura, pH, presença de diferentes íons, definição de sua natureza, determinação de sua massa e investigação de seu determinante genético. Na tentativa de purificar e identificar a toxina, foram utilizadas as técnicas de cromatografia liquida (HPLC), eletroforese (SDS-PAGE) e espectrometria de massa (MS). As linhagens de C. albicans (86,2%) e C. glabrata (60%) foram as mais sensíveis à micocina, seguidas pelas amostras de S. cerevisiae (50%) e por outras linhagens de K. ohmeri (50%); os dermatófitos testados foramresistentes. Os resultados indicam que a sensibilidade das amostras de C. albicans à micocina pode ter importância taxonômica, uma vez que foram substancialmente mais sensíveis que as demais espécies. Os resultados obtidos indicam que a micocina de K. ohmeri seja uma glicoproteína que possui massa acima de 30 kDa, sensível a temperaturas maiores ou iguais a 37°C, mais ativa entre pH 3,5 a 4,5; possui atividade antifúngica aumentada na presença de íons de cálcio e é possivelmente codificada por um gene plasmidial. Os testes realizados não indicaram que a micocina provoque morte celular por formação de poro na membrana celular.Killer toxins or mycocins are extracellular molecules produced by yeaststhat have a deleterious effect on organisms taxonomically related or not to its producers, without cell to cell contact. The yeast Kodamaea ohmeri, target of this study, was isolated from the cactus Opuntia sp. and was previously characterized as a killer yeast. Its killer toxin has a deleterious effect on Candida species, relevant opportunistic agents, whose medical importance is growing with the increasing number of immunocompromised patients or presenting other predisposing conditions. The search for new antifungal drugs becomes necessary, since these microorganisms are associated with high morbidity and mortality and some strains are less susceptible to traditionalantifungal drugs. This motivates the study of the killer toxin of K. ohmeri, which has not yet been characterized. The aims of this study were to determine the spectrum of action of the killer toxin as well as to characterize, purify and identify it. In order to determine its spectrum of action strains belonging to different Candida species, Saccharomyces cerevisiae, Kodamaea ohmeri and different species of dermatophytes were used. Along the experiments it became necessary to confirm the identity of some of the isolates used, previously identified by Candida fermentation API20AUX kit (Biomerieux). The confirmation was performed by growth on CHROMagar and ribosomal DNA sequencing. Theidentification of Candida by CRHOMagar was more accurate than that made by the APIAUX20, even considering its preferential application to C. albicans, C. krusei and C. tropicalis, since it was highly similar to that provided by sequencing. The characterization of the killer toxin was based on an evaluation of its resistance to temperature, pH, presence of different ions, definition of its nature, determination of its mass and investigation of its genetic determinant. For toxin purification and identification, liquid chromatography (HPLC), electrophoresis (SDS-PAGE) and mass spectrometry (MS) were used. The strains of C. albicans (86.2%) and C. glabrata (60%) were more sensitive to killer toxin followed by samples of S. cerevisiae (50%) and other strains of K.ohmeri (50%). The dermatophytes tested were resistant. The results indicate that the sensitivity of these samples to the killer toxin may be of taxonomic significance, since the species C. albicans is significantly more sensitive than other species. The results indicate that the killer toxin of K. ohmeri might be a glycoprotein having mass above 30kDa, sensitive to temperatures greater than or equal to 37°C, more active between pH 3.5 and 4.5, with antifungal activity increased in the presence of calcium ions and possibly encoded by a plasmidial gene. The tests performed until now did not indicate that cell death caused by the killer toxin would be by forming pores in cell membranes.Universidade Federal de Minas GeraisUFMGFungicidasMicrobiologiaLeveduras (Fungos)Candida AlbicansMicologiaToxinas KillerCandida albicansLeveduraKodamaea ohmeriToxina killerCaracterização e purificação da toxina killer produzida pela levedura Kodamaea ohmeri ES92info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisinfo:eu-repo/semantics/openAccessporreponame:Repositório Institucional da UFMGinstname:Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)instacron:UFMGORIGINALcapa___disserta__o_marina_lages.pdfapplication/pdf158211https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS-8WZHJS/1/capa___disserta__o_marina_lages.pdfd07f4e7548cc6c9d820ff4d249c614dbMD51TEXTcapa___disserta__o_marina_lages.pdf.txtcapa___disserta__o_marina_lages.pdf.txtExtracted texttext/plain9703https://repositorio.ufmg.br/bitstream/1843/BUOS-8WZHJS/2/capa___disserta__o_marina_lages.pdf.txt7a096956d20093bc224f205880724736MD521843/BUOS-8WZHJS2019-11-14 06:38:39.703oai:repositorio.ufmg.br:1843/BUOS-8WZHJSRepositório de PublicaçõesPUBhttps://repositorio.ufmg.br/oaiopendoar:2019-11-14T09:38:39Repositório Institucional da UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG)false
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