Purificação, caracterização e avaliação de atividade antimicrobiana de lectina de folhas de Portulaca elatior
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Data de Publicação: | 2019 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da UFPE |
Texto Completo: | https://repositorio.ufpe.br/handle/123456789/38364 |
Resumo: | Lectinas são proteínas de origem não-imunológica capazes de se ligar de forma seletiva e reversível a carboidratos, sendo amplamente difundidas na natureza e possuindo diversas aplicações biológicas, como atividade antimicrobiana. O presente trabalho teve como objetivos purificar e caracterizar uma lectina de folhas de Portulaca elatior (PeLL, P. elatior leaf lectin) e avaliar sua atividade antimicrobiana. As folhas de P. elatior foram secas, trituradas e homogeneizadas em NaCl 0,15 M (5%, p/v) durante 6 h para obtenção do extrato bruto (EB). O EB foi submetido à cromatografia em coluna de quitina, previamente equilibrada com NaCl 0,15 M. PeLL foi eluída com ácido acético 1,0 M, dialisada para remoção do eluente e avaliada quanto à atividade hemaglutinante (AH) e concentração de proteínas. A lectina foi avaliada por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida em condições nativas (PAGE) e desnaturantes (SDS-PAGE). A especificidade de ligação foi determinada por meio da incubação de PeLL com carboidratos e glicoproteínas anteriormente ao ensaio de AH. Estabilidade da AH de PeLL frente ao aquecimento e variação de pH também foi avaliada. Adicionalmente, o efeito de cátions divalentes na AH de PeLL foi determinado. No ensaio de atividade antimicrobiana, foram utilizadas as leveduras Candida albicans, Candida krusei, Candida parapsilosis e Candida tropicalis e as bactérias fitopatogênicas Pectobacterium carotovorum brasiliensis, Pectobacterium carotovorum e dois outros isolados de Pectobacterium sp. As concentrações mínima inibitória (CMI), mínima fungicida (CMF) e mínima bactericida (CMB) foram determinadas através do ensaio de microdiluição em caldo. EB apresentou concentração proteica de 4,55 mg/mL e AH específica de 0,439. As proteínas do extrato foram fracionadas com sulfato de amônio em diferentes saturações, no entanto as frações obtidas (precipitadas e sobrenadantes) não apresentaram AH. Na etapa cromatográfica utilizando o EB, o pico de proteínas adsorvidas e eluídas com ácido acético apresentou AH específica de 744,2 (fator de purificação de 1.695 vezes) e foi denominado PeLL. PeLL se apresentou como uma única banda polipeptídica em PAGE para proteínas nativas ácidas e não apresentou nenhuma banda em PAGE para proteínas básicas. SDS-PAGE revelou PeLL como uma única banda de massa molecular de aproximadamente 20 kDa. A AH de PeLL foi inibida principalmente por albumina sérica bovina, manose e galactose. A AH de PeLL não foi alterada pelo aquecimento por 30 min em temperaturas de até 100 ºC. Quando fervida por diferentes períodos, PeLL apresentou redução da AH somente após 5 h de incubação. 8 A lectina demonstrou ser mais ativa em faixa de pH ácido; por outro lado, a AH foi reduzida em pH 8 e 12 e não foi detectada em pH 7, 9, 10 e 11. PeLL não teve sua AH influenciada pela presença dos cátions Mg2+ e Ca2+ , mas teve sua AH parcialmente inibida por íons Mn2+. PeLL apresentou CMI de 0,185 µg/mL e CMB de 0,74 µg/mL para todas as bactérias testadas. Para as leveduras, foi determinado CMI de 1,48 µg/mL para C. albicans, C. krusei e C. tropicalis; já para C. parapsilosis foram obtidos CMI e CMF de 0,74 e 2,96 µg/mL, respectivamente. Análise por citometria de fluxo indicou que PeLL induz apoptose das células de Candida albicans. Em conclusão, uma nova lectina termestável e com atividade antimicrobiana foi isolada a partir do extrato de folhas de P. elatior. |
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As folhas de P. elatior foram secas, trituradas e homogeneizadas em NaCl 0,15 M (5%, p/v) durante 6 h para obtenção do extrato bruto (EB). O EB foi submetido à cromatografia em coluna de quitina, previamente equilibrada com NaCl 0,15 M. PeLL foi eluída com ácido acético 1,0 M, dialisada para remoção do eluente e avaliada quanto à atividade hemaglutinante (AH) e concentração de proteínas. A lectina foi avaliada por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida em condições nativas (PAGE) e desnaturantes (SDS-PAGE). A especificidade de ligação foi determinada por meio da incubação de PeLL com carboidratos e glicoproteínas anteriormente ao ensaio de AH. Estabilidade da AH de PeLL frente ao aquecimento e variação de pH também foi avaliada. Adicionalmente, o efeito de cátions divalentes na AH de PeLL foi determinado. No ensaio de atividade antimicrobiana, foram utilizadas as leveduras Candida albicans, Candida krusei, Candida parapsilosis e Candida tropicalis e as bactérias fitopatogênicas Pectobacterium carotovorum brasiliensis, Pectobacterium carotovorum e dois outros isolados de Pectobacterium sp. As concentrações mínima inibitória (CMI), mínima fungicida (CMF) e mínima bactericida (CMB) foram determinadas através do ensaio de microdiluição em caldo. EB apresentou concentração proteica de 4,55 mg/mL e AH específica de 0,439. As proteínas do extrato foram fracionadas com sulfato de amônio em diferentes saturações, no entanto as frações obtidas (precipitadas e sobrenadantes) não apresentaram AH. Na etapa cromatográfica utilizando o EB, o pico de proteínas adsorvidas e eluídas com ácido acético apresentou AH específica de 744,2 (fator de purificação de 1.695 vezes) e foi denominado PeLL. 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The CE was submitted to chromatography on chitin column, previously equilibrated with 0.15 M NaCl. PeLL was eluted with 1.0 M acetic acid, dialyzed to remove the eluent and evaluated for hemagglutinating activity (HA) and protein concentration. The lectin was evaluated by polyacrylamide gel electrophoresis under native (PAGE) and denaturant (SDS-PAGE) conditions. The binding specificity was determined by incubating PeLL with carbohydrates and glycoproteins prior to the HA assay. Stability of PeLL HA to heating and pH variation was also evaluated. Additionally, the effect of divalent cations on the HA of PeLL was determined. In the antimicrobial activity assay, it was used the yeasts Candida albicans, Candida krusei, Candida parapsilosis and Candida tropicalis and the phytopathogenic bacteria Pectobacterium carotovorum brasiliensis, Pectobacterium carotovorum carotovorum and two other isolates of Pectobacterium sp. Minimal inhibitory (MIC), fungicide (MFC) and bactericidal (MBC) concentrations were determined by the broth microdilution assay. The CE showed protein concentration of 4.55 mg/mL and specific HA of 0.439. The extract proteins were fractionated with ammonium sulfate at different saturations, however the obtained fractions (precipitates and supernatants) did not present HA. In the chromatographic step using the CE, the peak of proteins adsorbed and eluted with acetic acid presented specific HA of 744.2 (purification factor of 1,695 times) and was denominated PeLL. PeLL presented a single polypeptide band on PAGE for native acidic proteins and no band in PAGE for basic proteins. SDS-PAGE revealed PeLL as a single band of approximately 20 kDa. PeLL HA was inhibited mainly by bovine serum albumin, mannose and galactose. The HA of PeLL was not altered by heating for 30 min at temperatures up to 100 °C. When boiled for different periods, PeLL presented a reduction of HA only after 5 h of incubation. The lectin was shown to be more active at the acid pH range; on the other hand, HA was reduced at pH 8 and 12 and was not detected at pH 7, 9, 10 and 11. PeLL did not have its HA influenced by the presence of Mg2+ and Ca2+ cations, but its HA was partially inhibited by Mn2+. PeLL presented 10 MIC of 0.185 μg/mL and MBC of 0.74 μg/mL for all bacteria tested. For yeasts, CMI of 1.48 μg/mL was determined for C. albicans, C. krusei and C. tropicalis; for C. parapsilosis, MIC and MFC of 0.74 and 2.96 μg/mL, respectively, were obtained. Flow cytometric analysis indicated that PeLL induced apoptosis of Candida albicans cells. In conclusion, a new thermostable lectin with antimicrobial activity was isolated from the P. elatior leaf extract.porUniversidade Federal de PernambucoPrograma de Pos Graduacao em Ciencias BiologicasUFPEBrasilAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Brazilhttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/br/info:eu-repo/semantics/embargoedAccessLectinasPortulaca elatiorAtividade antimicrobianaPurificação, caracterização e avaliação de atividade antimicrobiana de lectina de folhas de Portulaca elatiorinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesismestradoreponame:Repositório Institucional da UFPEinstname:Universidade Federal de Pernambuco (UFPE)instacron:UFPECC-LICENSElicense_rdflicense_rdfapplication/rdf+xml; charset=utf-8811https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/38364/2/license_rdfe39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34MD52ORIGINALDISSERTAÇÃO Suéllen Pedrosa da Silva.pdfDISSERTAÇÃO Suéllen Pedrosa da Silva.pdfapplication/pdf828163https://repositorio.ufpe.br/bitstream/123456789/38364/1/DISSERTA%c3%87%c3%83O%20Su%c3%a9llen%20Pedrosa%20da%20Silva.pdf3a4b03b09cfd21604538001f461d3defMD51LICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; 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