Lipases de metagenômica : caracterização de uma nova lipase LIPMF3 e modificação estrutural da lipase LIPC12

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Almeida, Janaína Marques de
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFPR
Texto Completo: https://hdl.handle.net/1884/81256
Resumo: Orientadora: Profª. Dra. Nadia Krieger
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spelling Müller-Santos, Marcelo, 1979-Moure, Vivian Rotuno, 1984-Universidade Federal do Paraná. Setor de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Ciências (Bioquímica)Krieger, Nadia, 1952-Almeida, Janaína Marques de2023-12-15T16:57:21Z2023-12-15T16:57:21Z2019https://hdl.handle.net/1884/81256Orientadora: Profª. Dra. Nadia KriegerCoorientadores: Prof. Dr. Marcelo Müller dos Santos, Dra. Vivian Rotuno MoureTese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Ciências - Bioquímica. Defesa : Curitiba, 07/12/2018Inclui referênciasResumo: O uso intensivo de lipases como biocatalisadores em síntese orgânica tem impulsionado a busca por novas lipases e o melhoramento de lipases conhecidas. Neste contexto, o presente trabalho apresenta os estudos realizados com duas lipases isoladas de uma biblioteca metagenômica, construída a partir de solo contaminado com gordura animal (SCGA). A primeira parte do trabalho investigou os efeitos da Histag na estrutura, atividade, estabilidade e imobilização de LipC12, uma lipase previamente caracterizada. LipC12 foi purificada com a His-tag na região N-terminal por cromatografia de afinidade, em seguida, a His-tag foi removida utilizando a protease do vírus do mosaico do tabaco (TEV). A estrutura geral de LipC12 não foi afetada pela remoção da His-tag, como confirmado por análise de dicroísmo circular. As atividades de hidrólise específicas contra os substratos naturais e artificiais foram significativamente maiores com LipC12 sem His-tag. No entanto, esta variante de LipC12 apresentou menor atividade e estabilidade na presença de solventes orgânicos polares em relação à LipC12 com His-tag. A eficiência de imobilização em Immobead 150 foi de 100% para as duas variantes de LipC12 e estudos de dessorção de proteínas confirmaram que a His-tag não participa de ligações covalentes com o suporte. Para LipC12 imobilizada, a His-tag também influenciou negativamente a atividade de hidrólise, mas influenciou positivamente na atividade de esterificação. Isto abre a possibilidade de modular a atividade de LipC12 para diferentes reações: a Histag pode ser mantida para reações de hidrólise ou removida para reações de síntese. A segunda parte do trabalho foi a caracterização da nova lipase LipMF3. Esta lipase requer uma foldase para o seu correto enovelamento, de modo que os genes lipMF3 e lifMF3, que codificam para a lipase e sua foldase, respectivamente, foram amplificados e clonados. Estes genes foram co-expressos em Escherichia coli, em seguida, o complexo Lip-LifMF3 foi purificado por cromatografia de afinidade e caraterizado bioquimicamente. A estrutura tridimensional do complexo também foi determinada por modelagem por homologia. Através de análise filogenética, LipMF3 foi classificada como pertencente à subfamília I.1 de lipases bacterianas, apresentando identidade de sequência de 68% e 67% com lipases de Chromobacterium violaceum e C. amazonense, respectivamente. LipMF3 apresenta alta atividade de hidrólise contra triacilgliceróis de cadeia curta, média e longa (1650 ± 46 U mg-1 para tributirina, 1314 ± 68 U mg-1 para tricaprilina e 862 ± 62 U mg-1 para óleo de oliva). A maior atividade de LipMF3 foi a 40 °C e pH 6,5. A enzima foi estável por 3 horas em solventes orgânicos, apresentando atividade residual em torno de 100% na presença de 25% (v/v) de DMSO, isopropanol, metanol, etanol, propanol e butanol. Apresentou estabilidade também em uma ampla faixa de pH (5,5 a 11) com atividade residual acima de 80%. LipMF3 foi imobilizada em um suporte hidrofílico (Immobead 150P) e em um suporte hidrofóbico (Sepabeads FP-BU), com melhores resultados de imobilização obtidos com Sepabeads. Esta preparação apresentou uma conversão de 94% em 5 h de reação para síntese de oleato de etila. Na resolução cinética de (R,S)-1-fenil-1-etanol, apresentou um excesso enantiomérico (ee) de 90% para o produto (R)-1-feniletil acetato. Esta nova lipase possui, portanto, potencial de aplicação em reações biotecnológicas.Abstract: The intensive use of lipases as biocatalysts in organic synthesis has driven the search for new lipases and the improvement of known lipases. In this context, the current work presents the studies undertaken with two lipases isolated from a metagenomic library constructed from fat-contaminated soil. The first part of the work investigated the effects of the His-tag on the structure, activity, stability and immobilization of the LipC12, a lipase that has previously been characterized. LipC12 was purified with a His-tag at the N-terminal region by affinity chromatography, then the His-tag was removed using protease from Tobacco Etch Virus (TEV). The overall structure of LipC12 was not affected by the removal of His-tag, as confirmed by circular dichroism analysis. The specific hydrolytic activities against natural and artificial substrates were significantly higher for LipC12 without His-tag. However, this form of LipC12 had a lower activity and stability in the presence of polar organic solvents than LipC12 with His-tag. The efficiency of immobilization on Immobead 150 was 100% for the two LipC12 variants and protein desorption studies confirmed that the His-tag does not participate in covalent bonding with the support. For immobilized LipC12, the Histag also negatively influenced the hydrolytic activity, but positively influenced the esterification activity. This opens up the possibility of modulating the activity of LipC12 for different reactions: the His-tag can be maintained for hydrolysis reactions or removed for synthesis reactions. The second part of the work was the characterization of the new lipase LipMF3. This lipase requires a foldase for correct folding, so the genes lipMF3 and lifMF3, which code for the lipase and its foldase, respectively were amplified and cloned. These genes were co-expressed in Escherichia coli, then Lip- LifMF3 complex was purified by affinity chromatography and characterized biochemically. The three-dimensional structure of the complex was also determined by homology modeling. Through phylogenetic analysis, LipMF3 was classified as belonging to the subfamily I.1 of bacterial lipases, presenting sequence identities of 68% and 67% with lipases of Chromobacterium violaceum and C. amazonense, respectively. LipMF3 has high hydrolytic activity against short-, medium- and longchain triacylglycerols (1650 ± 46 U mg-1 for tributyrin, 1314 ± 68 U mg-1 for tricaprylin and 862 ± 62 U mg-1 for olive oil). The highest activity of LipMF3 was at 40 °C and pH 6.5. The enzyme was stable for 3 hours in organic solvents, with residual activity around 100% in the presence of 25% (v/v) of DMSO, isopropanol, methanol, ethanol, propanol and butanol. It also showed stability over a wide range of pH (5.5 to 11) with residual activity above 80%. LipMF3 was immobilized onto a hydrophilic support (Immobead 150P) and a hydrophobic support (Sepabeads), with better results for immobilization obtained with Sepabeads. This preparation gave 94% conversion in 5 h for the synthesis of ethyl oleate. In the kinetic resolution of (R,S)-1-phenyl-1-ethanol, it gave an enantiomeric excess (ee) of 90% for the product (R)-1-phenylethyl acetate. This new lipase therefore has potential for application in biotechnological reactions.1 recurso online : PDF.application/pdfLipaseMetagenômicaBiocatáliseBioquímicaLipases de metagenômica : caracterização de uma nova lipase LIPMF3 e modificação estrutural da lipase LIPC12info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisporreponame:Repositório Institucional da UFPRinstname:Universidade Federal do Paraná (UFPR)instacron:UFPRinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINALR - T - JANAINA MARQUES DE ALMEIDA.pdfapplication/pdf6905268https://acervodigital.ufpr.br/bitstream/1884/81256/1/R%20-%20T%20-%20JANAINA%20MARQUES%20DE%20ALMEIDA.pdf930a315f558ba900b90a3a485a95cc6cMD51open access1884/812562023-12-15 13:57:22.013open accessoai:acervodigital.ufpr.br:1884/81256Repositório de PublicaçõesPUBhttp://acervodigital.ufpr.br/oai/requestopendoar:3082023-12-15T16:57:22Repositório Institucional da UFPR - Universidade Federal do Paraná (UFPR)false
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