Clonagem, expressão e purificação de lipase de Staphylococcus xylosus e detecção de genes de enterotoxinas de Staphylococcus aureus isolados de produtos de origem animal

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Pelisser, Marcia Regina
Data de Publicação: 2008
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UFSC
Texto Completo: http://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/91335
Resumo: Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Ciência dos Alimentos
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spelling Universidade Federal de Santa CatarinaPelisser, Marcia ReginaArisi, Ana Carolina Maisonnave2012-10-23T21:39:52Z2012-10-23T21:39:52Z20082008263770http://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/91335Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias. Programa de Pós-graduação em Ciência dos AlimentosStaphylococcus xylosus é um microrganismo envolvido na fermentação de produtos cárneos e produtor de lipases extracelulares, que catalisam a hidrólise e a síntese de ésteres formados por glicerol e ácidos graxos e são ferramentas valiosas em biotecnolgia. O objetivo deste trabalho foi clonar, expressar e purificar lipase recombinante de uma linhagem de Staphylococcus xylosus isolada de lingüiça colonial produzida no sul do Brasil. A extração de DNA foi realizada a partir de linhagens de S. xylosus isoladas de lingüiça colonial e de uma linhagem padrão de S. xylosus (ATCC 29971). Os fragmentos correspondentes a região madura da lipase (AF208229) foram amplificados (1,1 kb) e clonados em plasmídio pGEM-T Easy. As seqüências obtidas apresentaram homologia de 99% com o gene de lipase de S. xylosus AF208229. Estes fragmentos que correspondem à região de codificação da lipase madura foram inseridos em um plasmídeo pET14b para construir as proteínas-fusão. As proteínasfusão foram expressas em E. coli e purificadas em coluna de afinidade por metal imobilizado de níquel. As proteínas purificadas apresentaram atividade de lipase usando ésteres de p-nitrofenilpalmitato e p-nitrofenilbutirato como substratos. Desta forma, a lipase obtida a partir de Staphylococcus xylosus apresenta potencial de aplicabilidade na indústria de embutidos cárneos fermentados. Entre as bactérias predominantes envolvidas em doenças transmitidas por alimentos está a bactéria Staphylococcus aureus que produz enterotoxinas nos alimentos provocando intoxicação gastrintestinal. Os objetivos da pesquisa foram avaliar a contaminação por estafilococos coagulase positiva (ECP) em produtos cárneos e derivados de leite comercializados em Santa Catarina e detectar por PCR multiplex a presença dos genes que codificam as enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e SEE e gene específico para espécie S. aureus. Foram coletadas 72 amostras de alimentos entre queijos tipo mussarella (15), prato (15) e colonial (15), lingüiça colonial (18) e salaminho (09) em estabelecimentos comerciais na região do Alto Uruguai Catarinense em Santa Catarina. Foram realizadas a contagem de estafilococos coagulase positiva (ECP) e a detecção por PCR dos genes específicos para S. aureus (femA) e para os genes (sea, seb, sec, sed e see) das enterotoxinas SEA, SEB, SEC, SED e SEE, a partir do DNA extraído de 102 cepas isoladas das amostras. A presença de ECP foi detectada em 33 amostras (45,8%) de produtos de origem animal analisadas e as contagens de ECP estavam acima do valor máximo permitido pela legislação (103 UFC.g-1) em 22 amostras (30,5%). De 102 cepas isoladas ECP, para 91 (89,2%) cepas ocorreu a amplificação do gene femA. A amplificação dos genes sea, sed e see que codificam as enterotoxinas, ocorreu em 10, 12 e 4 cepas, respectivamente. Os resultados do presente trabalho confirmam que a PCR multiplex é um método rápido e sensível para análise de varredura de Staphylococcus coagulase positiva interotoxigênico, sendo altamente específica. Este trabalho sugere que os produtos analisados podem conter as enterotoxinas SEA, SED e SEE e aponta a necessidade de melhoria na produção e nos sistemas de fiscalização dos produtos analisados. Staphylococcus xylosus causes fermentation in meat products and produces extracellular lipases which catalyze hydrolysis and synthesis from esters formed by glycerol and fatty acids. These lipases are also valuable tools to biotechnolgy. The aim of this work was cloning, sequencing and express a S. xylosus recombinant lipase. The DNA extraction was made from S. xylosus strains isolated from artisanal salami and from a S. xylosus standard strain (ATCC 29971). Fragments corresponding to a mature lipase (AF208229) were amplified (1.1 kb) and cloned into pGEM-T Easy plasmid. The sequences obtained showed 99% homology with the lipase gene of S. xylosus AF208229. Fragments corresponding to the mature region of lipase were inserted into a pET14b plasmid to build fusion proteins containing histidine tail. Fusion-proteins were expressed into E. coli and then purified with nickel affinity column. Purified proteins showed lipase activity using p-nitrophenilpalmitate and p-nitrophenilbutirate esters as substrates. The lipase obtained from Staphylococcus xylosus has a potential applicability in the fermented meat industry. The other organism studied was Staphylococcus aureus which is involved in food diseases and produce enterotoxins in food causing gastrointestinal poisoning. Contamination by coagulase-positive Staphylococci (CPS) in meat and milk-derived products commercialized in Santa Catarina, Brazil was evaluated and the presence of genes for classical staphylococcal enterotoxins A, B, C, D and E (sea, seb, sec, sed and see) and for gene femA, specific por S. aureus species, by multiplex PCR, detected. A total of 72 food samples including mozzarella (15 samples), American cheese (15 samples), colonial cheese (15 samples), colonial sausage (18 samples) and salaminho (09 samples) were analised. Of 102 strains isolated CPS, for 91 (89.2%) strains of gene amplification occurred at fema. The amplification of genes sea, sed and see coding for enterotoxins, occurred in 10, 12 and 4 strains, respectively. Results of the present work confirm that multiplex PCR is a rapid and sensitive method for screening of enterotoxigenic coagulase-positive Staphylococci, being highly specific. Results also indicate that better hygiene practices and better inspection are required in the production of the foods included in the study.110 f.| il., grafs., tabs.porFlorianópolis, SCTecnologia de alimentosCiência dos alimentosLipaseStaphylococcus xylosusEstafilococos aureosEnterotoxinasReacao em cadeia de polimeraseClonagem, expressão e purificação de lipase de Staphylococcus xylosus e detecção de genes de enterotoxinas de Staphylococcus aureus isolados de produtos de origem animalinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisreponame:Repositório Institucional da UFSCinstname:Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)instacron:UFSCinfo:eu-repo/semantics/openAccessORIGINAL263770.pdfapplication/pdf3998274https://repositorio.ufsc.br/bitstream/123456789/91335/1/263770.pdf425226ccd7df05c5e380b6db8a2580d6MD51TEXT263770.pdf.txt263770.pdf.txtExtracted Texttext/plain213995https://repositorio.ufsc.br/bitstream/123456789/91335/2/263770.pdf.txtb17488de60185d4fb666e07965ab5d6aMD52THUMBNAIL263770.pdf.jpg263770.pdf.jpgGenerated Thumbnailimage/jpeg1206https://repositorio.ufsc.br/bitstream/123456789/91335/3/263770.pdf.jpg686fc81aebb0710116e39ccb15db2624MD53123456789/913352013-05-04 13:59:09.861oai:repositorio.ufsc.br:123456789/91335Repositório de PublicaçõesPUBhttp://150.162.242.35/oai/requestopendoar:23732013-05-04T16:59:09Repositório Institucional da UFSC - Universidade Federal de Santa Catarina (UFSC)false
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