Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Janner, Christiane Ribeiro
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio.unb.br/handle/10482/18285
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015.
id UNB_5c4de521deaa620371ffe79e5f1022d8
oai_identifier_str oai:repositorio2.unb.br:10482/18285
network_acronym_str UNB
network_name_str Repositório Institucional da UnB
repository_id_str
spelling Janner, Christiane RibeiroReis, Viviane Castelo BrancoTorres, Fernando Araripe Gonçalves2015-05-27T12:18:19Z2015-05-27T12:18:19Z2015-05-272015-03-26JANNER, Christiane Ribeiro. Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae. 2015. viii, 85 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2015.http://repositorio.unb.br/handle/10482/18285Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015.Para o melhor aproveitamento da biomassa na produção de etanol lignocelulósico, a xilose, principal açúcar que compõe a hemicelulose, poderia ser fermentada juntamente com a glicose. No processo fermentativo, o micro-organismo mais utilizado é a levedura Saccharomyces cerevisiae, uma excelente produtora de etanol. Contudo, esta levedura não é capaz de fermentar pentoses, como a xilose. Embora já tenham sido desenvolvidas linhagens recombinantes que são capazes de metabolizar xilose, o processo ainda não é eficiente, sendo uma das limitações o transporte deste açúcar, que é realizado por meio de transportadores de hexose. Para analisar o influxo de xilose e assim verificar a afinidade de transportadores capazes de realizar a internalização deste açúcar, foi construído um nanosensor baseado na proteína periplasmática XBP (Xylose Binding Protein) e em proteínas fluorescentes. Assim, a XBP foi fusionada e flanqueada por duas variantes da GFP (Green Fluorescent Protein), a eCFP (Cyan Fluorescent Protein) e a Vênus (Yellow Fluorescent Protein), cujos espectros de emissão e excitação, respectivamente, são sobrepostos, permitindo assim a ocorrência do FRET. Alterações neste fenômeno podem ser mensuradas, permitindo o monitoramento de moléculas com resolução espacial e temporal in vivo e de mudanças conformacionais de proteínas associadas à interação de um ligante. Além disso, foi construída uma versão truncada do nanosensor, portando uma deleção na XBP para monitorar o processo de ligação do açúcar à proteína, mediante uma alteração mais expressiva do FRET. Primeiramente foram realizados estudos de modelagem a fim de verificar se o nanosensor apresentaria uma estrutura que favoreceria o FRET. Com a sequência definida, o gene foi sintetizado e posteriormente, foi realizada uma deleção de 69 pb no domínio de ligação à xilose por meio de PCR. Os dois genes codantes para o nanosensor intacto e truncado foram expressos em Escherichia coli. Após a purificação de ambas as proteínas por meio de cromatografia de afinidade, verificou-se ocorrência do FRET por ensaios de fluorimetria para os dois nanosensores. O nanosensor intacto exibiu uma Kd por xilose de aproximadante 3,41 μM a 25 ºC enquanto que o nanosensor truncado apresentou uma Kd de aproximadamente 0,97 μM na mesma temperatura, possuindo este maior afinidade pelo açúcar que o nanosensor intacto. Para este também foram calculados os parâmetros termodinâmicos da interação, a qual exibiu um H de aproximadamente 13 kcal/mol, S de 68 cal/mol.K e G de -7 kcal/mol. Estes valores indicam que a interação é espontânea, entropicamente guiada e favorecida por interações hidrofóbicas. Ensaios de especificidade do nanosensor intacto demonstraram que este também possui afinidade pelos açúcares xilulose (Kd de 0,24 μM) e xilitol (Kd de 0,31 μM). A expressão do nanosensor intacto em Saccharomyces cerevisiae revelou que os fluoróforos encontram-se funcionais no citoplasma da célula, porém não foi verificada a ocorrência do FRET, sendo necessária a otimização do ensaio in vivo. _______________________________________________________________________ ABSTRACTXylose, a highly abundant pentose present in hemicellulose, can be fermented along with glucose to improve harnessing of biomass to produce lignocellulosic ethanol. The yeast Saccharomyces cerevisiae is widely used in fermentative processes but is unable to use pentoses. Although strains that metabolize xylose had already been developed, the process remains inefficient. One bottleneck is the uptake of this sugar, since this is carried out by hexose transporters. Hence, studies on xylose transport are of utmost interest. In order to analyze the xylose uptake and therefore evaluate the affinity of sugar transporters, a nanosensor was built based on XBP (Xylose Binding Protein) fused to two variants of GFP (Green Fluorescent Protein), the eCFP and the eYFP, whose emission and excitation spectra, respectively, are overlapped, allowing the occurrence of FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Modifications in this phenomenon can be measured, which enables molecules monitoring of conformational changes in proteins, which is associated with a binding event. Besides, a new version of the nanosensor was constructed by PCR, which contains a deletion in XBP in order to evaluate if there is an increase in FRET efficiency. First of all, modelling studies were performed to verify if the nanosensor would present a tridimensional structure that enables the FRET occurrence. Then, the encoding genes for both nanosensors were expressed in Escherichia coli. Following the protein purification of both nanosensors by affinity chromatography, the occurrence of FRET was checked by fluorimetric assays. The intact nanosensor exhibited a Kd of 3,41 μM at 25 ºC, while the truncated nanosensor exhibited 0,97 μM for Kd at the same temperature, demonstrating that the last one has more affinity for xylose than the intact nanosensor. For this, the thermodynamics parameters of the interaction were calculated, which exhibited a H of 13 kcal/mol, S of 68 cal/mol and a G of -7 kcal/mol. These values indicated that the interaction is spontaneous, driving by entropy and favored by hydrophobic interactions. Also, specificity assays for intact nanosensor showed that it has affinity for xylulose (Kd of 0,24 μM) and xylitol (Kd of 0,31 μM). The expression of the intact nanosensor in Saccharomyces cerevisiae showed that the fluorophores are functional, but occurrence of FRET was not observed, being necessary the optimization of the in vivo assay.A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessConstrução e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiaeinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisTransferência de energia de ressonância por fluorescênciaNanosensoresÁlcool - produçãoXiloseporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBORIGINAL2015_ChristianeRibeiroJanner.pdf2015_ChristianeRibeiroJanner.pdfapplication/pdf3587734http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/18285/1/2015_ChristianeRibeiroJanner.pdf6494e7c26c43ea25cd5467838b18e9b9MD51open accessLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain772http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/18285/2/license.txt012fd10bbae5b61153499f78d47b3195MD52open access10482/182852023-07-13 17:52:06.084open accessoai:repositorio2.unb.br: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Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestopendoar:2023-07-13T20:52:06Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
dc.title.en.fl_str_mv Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae
title Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae
spellingShingle Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae
Janner, Christiane Ribeiro
Transferência de energia de ressonância por fluorescência
Nanosensores
Álcool - produção
Xilose
title_short Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae
title_full Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae
title_fullStr Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae
title_full_unstemmed Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae
title_sort Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae
author Janner, Christiane Ribeiro
author_facet Janner, Christiane Ribeiro
author_role author
dc.contributor.advisorco.none.fl_str_mv Reis, Viviane Castelo Branco
dc.contributor.author.fl_str_mv Janner, Christiane Ribeiro
dc.contributor.advisor1.fl_str_mv Torres, Fernando Araripe Gonçalves
contributor_str_mv Torres, Fernando Araripe Gonçalves
dc.subject.keyword.en.fl_str_mv Transferência de energia de ressonância por fluorescência
Nanosensores
Álcool - produção
Xilose
topic Transferência de energia de ressonância por fluorescência
Nanosensores
Álcool - produção
Xilose
description Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2015.
publishDate 2015
dc.date.submitted.none.fl_str_mv 2015-03-26
dc.date.accessioned.fl_str_mv 2015-05-27T12:18:19Z
dc.date.available.fl_str_mv 2015-05-27T12:18:19Z
dc.date.issued.fl_str_mv 2015-05-27
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/masterThesis
format masterThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.citation.fl_str_mv JANNER, Christiane Ribeiro. Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae. 2015. viii, 85 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2015.
dc.identifier.uri.fl_str_mv http://repositorio.unb.br/handle/10482/18285
identifier_str_mv JANNER, Christiane Ribeiro. Construção e caracterização de nanosensor para o monitoramento do influxo de xilose em Saccharomyces cerevisiae. 2015. viii, 85 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2015.
url http://repositorio.unb.br/handle/10482/18285
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Repositório Institucional da UnB
instname:Universidade de Brasília (UnB)
instacron:UNB
instname_str Universidade de Brasília (UnB)
instacron_str UNB
institution UNB
reponame_str Repositório Institucional da UnB
collection Repositório Institucional da UnB
bitstream.url.fl_str_mv http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/18285/1/2015_ChristianeRibeiroJanner.pdf
http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/18285/2/license.txt
bitstream.checksum.fl_str_mv 6494e7c26c43ea25cd5467838b18e9b9
012fd10bbae5b61153499f78d47b3195
bitstream.checksumAlgorithm.fl_str_mv MD5
MD5
repository.name.fl_str_mv Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)
repository.mail.fl_str_mv
_version_ 1797405203385810944

Registros relacionados