Imobilização de enzimas na parede celular de Saccharomyces cerevisiae para produção de etanol a partir de amido

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Baptista, Carolina Brêttas
Data de Publicação: 2013
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: http://repositorio.unb.br/handle/10482/13195
Resumo: Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de pós-graduação em Biologia Molecular, 2013.
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spelling Baptista, Carolina BrêttasTorres, Fernando Araripe GonçalvesMoraes, Lídia Maria Pepe de2013-05-24T12:05:32Z2013-05-24T12:05:32Z2013-05-242013-02-22BAPTISTA, Carolina Brêttas. Imobilização de enzimas na parede celular de Saccharomyces cerevisiae para produção de etanol a partir de amido. 2013. ix, 134 f., il. Dissertação (Mestrado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2013.http://repositorio.unb.br/handle/10482/13195Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de pós-graduação em Biologia Molecular, 2013.A utilização da biomassa tem se tornado uma atrativa fonte alternativa para a produção de energia. A levedura Saccharomyces cerevisiae é o micro-organismo mais utilizado na indústria de fermentação alcoólica, porém não possui atividade amilolítica. Portanto, a modificação genética dessa levedura vem sendo feita para obteção de novas linhagens amilolíticas. O presente trabalho teve como objetivo a construção de um vetor de expressão de proteínas heterólogas na superfície de S. cerevisiae para coexpressar a enzima α-amilase de Bacillus subtilis juntamente com a glicoamilase de Aspergillus awamori na parede celular da levedura. Para ancorar as proteínas de interesse à parede foi feita a fusão destas com a região C-terminal da α-aglutinina da própria levedura, contendo a sequencia sinal para adição da âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) e as proteínas expressas na linhagem MFL. Utilizou-se três formas diferentes de glicoamilase, uma contendo o gene completo (gla1), outra apenas com o domínio catalítico e a região altamente O- glicosilada (gla2) e uma última com domínio catalítico e parte da região O- glicosilada (gla3). Os testes de atividade mostraram que a enzima α-amilase aderiu à parede celular, porém a maior parte da proteína produzida ainda era secretada para fora da célula. As maiores atividades encontradas para as construções contendo α-amilase fusionada à porção C-terminal da α-aglutinina foi de 0,99 ± 0,02 U/mL e 89,43 ± 5,27 U/mL, associada à célula e no sobrenadante, respectivamente. A secreção da α-amilase para o meio de cultura apresentou grande aumento quando fusionada a outra proteína. A atividade observada para glicoamilase também foi maior no sobrenadante de cultura. As três diferentes formas de glicoamilase fusionadas à α-aglutinina não apresentaram diferenças significativas de expressão entre si. A análise do perfil secretório mostrou que as enzimas fusionadas encontradas no sobrenadante de cultura apresentam a mesma massa molecular da enzima secretada sem fusão alguma. ______________________________________________________________________________ ABSTRACTBiomass has become an attractive alternative source for energy production. The yeast Saccharomyces cerevisiae is the most used microorganism in industrial fermentation, however it doesn’t have amylolytic activity. Therefore, molecular engineering of this yeast have been done to obtain new amylolytic strains. The aim of this work was to construct a vector for expression of heterologous proteins on the cell surface of S. cerevisiae to coexpress the α-amylase from Bacillus subtilis and the glucoamylase of Aspergillus awamori in the yeast cell wall. To anchor the proteins to the wall, they were fused with the C-terminal region of α-agglutinin containing the signal sequence for addition of glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchor and the protein produced expressed in the MFL strain. We used three different forms of glucoamylase: one containing the complete gene (gla1), another with only the catalytic domain and the highly-glycosylated region (gla2) and the last one with a catalytic domain and part of the O-glycosylated region (gla3). The activity tests showed that the enzyme α-amylase was attached to the cell wall, but most of the produced protein was secreted to the culture medium. The highest activities found for the constructs containing α-amylase fused to the C-terminal region of α-agglutinin was 0,99 ± 0,02 U/mL and 89,43 ± 5,27 U/mL, to pellet and supernatant, respectively. The secretion of α-amylase protein was greatly increased when fused to another protein. The activity found for glucoamylase was also higher in the culture supernatant. The three different forms of glucoamylase fused to C-terminal region of α-agglutinin showed no significant differences in expression among them. The secretory analysis showed that merged enzymes found in the culture’s supernatant presented the same molecular mass as the enzyme secreted without any fusion.A concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições: Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessImobilização de enzimas na parede celular de Saccharomyces cerevisiae para produção de etanol a partir de amidoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisEnzimasLevedurasProteínasBiomassaÁlcoolporreponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBORIGINAL2013_CarolinaBrettasBaptista.pdf2013_CarolinaBrettasBaptista.pdfapplication/pdf9474008http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/13195/1/2013_CarolinaBrettasBaptista.pdf13d2a383bdfe08584345d3d55c5e2e79MD51open accessLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain772http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/13195/2/license.txtda7b20a5d0ba24d937e2107257966eb5MD52open access10482/131952023-07-13 17:52:12.215open accessoai:repositorio2.unb.br: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Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestopendoar:2023-07-13T20:52:12Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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