Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria : mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclico

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Cardoso, Marcia Helena Miranda
Data de Publicação: 2006
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602657
Resumo: Orientador: Edson Antunes
id UNICAMP-30_1fe3da04552abd85f8a3391e517f5546
oai_identifier_str oai::368002
network_acronym_str UNICAMP-30
network_name_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository_id_str
spelling Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria : mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclicoEffect of nitric oxide on platelet adhesion : cyclic GMP dependent and independent mechanismsÓxido nítricoAdesividade plaquetariaInibidores da agregação de plaquetasDoadores de óxido nítricoNitroprussiatoNitric oxidePlatelet adhesivenessPlatelet agregatuin inhibitorsNitric oxide donorsNitroprussideOrientador: Edson AntunesTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias MedicasResumo: A inibição da adesão de plaquetas ao subendotélio é fundamental na prevenção de agregação excessiva e de formação de trombos, sendo o óxido nítrico (NO) o principal mediador envolvido neste fenômeno. O objetivo deste estudo foi investigar o mecanismo de ação do NO na inibição da adesão de plaquetas humanas, procurando identificar os mecanismos dependentes e independentes de GMP cíclico (GMPc). Os ensaios de adesão foram realizados em placas de 96 poços recobertos com fibrinogênio, usando-se plaquetas lavadas (1,2 x 108 plaquetas/mL) obtidas de indivíduos sadios. Dependendo do protocolo experimental, as plaquetas não ativadas e ativadas com trombina (50 mU/mL) foram incubadas com SNP (0,1-1,0 mM) ou SIN-1 (0,1-1,0 mM), na ausência ou na presença de ODQ (inibidor da guanilato ciclase solúvel), SOD (seqüestrador do ânion superóxido) ou gaiato (antioxidante seqüestrador de peroxinitrito). A adesão foi avaliada aos 15 e 60 min de incubação, medindo-se a atividade da fostase ácida. Nossos resultados mostraram que as plaquetas se aderem significativamente ao fibrinogênio in vitro, sendo a resposta em 60 min maior do que em 15 min. O tratamento das plaquetas com SNP (0,1 e 1,0 mM) elevou significativamente os níveis de GMPc e reduziu a adesão plaquetána aos 15 e 60 min. A pré-incubação das plaquetas com ODQ impediu a elevação dos níveis de GMPc induzida pelo SNP (ambas as concentrações e tempos), e reverteu a inibição da adesão plaquetária observada com 0,1 mM de SNP Entretanto, o ODQ não modificou a inibição da adesão quando se usou 1,0 mM de SNP. Por outro lado, a pré-incubação das plaquetas com SOD ou gaiato reverteu significamente o efeito inibitório de 1 mM de SNP. Resultados semelhantes foram obtidos com o SIN-1 em todas as condições experimentais. No sentido de descartar que a inibição da adesão plaquetária proporcionada pelos doadores de NO não é decorrente de efeito citotóxico, realizamos ensaios de citotoxicidade (MTT). Nossos dados revelaram que o SNP não é tóxico à plaqueta em nenhuma das concentrações e condições usadas. Por outro lado, o SIN-1 mostrou-se tóxico na concentração de 1 mM, sendo este efeito citotóxico revertido pela pré-incubação das palquetas com SOD. Numa segunda etapa deste trabalho, passamos à investigação do componente independente de GMPc responsável pela inibição da adesão plaquetária em resposta ao SNP e SIN-1, dando ênfase à nitrotirosina. A incubação de plaquetas com SNP (0,1 mM) por 15 min não revelou nenhuma proteína nitrada, mas quando as plaquetas foram tratadas com concentração maior de SNP (1 mM) ou SIN-1, houve o aparecimento de uma nitração de proteína nos resíduos de tirosina com uma massa molecular aparente de 110 kDa, identificada como alfa-actinina-1. A nitração foi aumentada em plaquetas ativadas com trombina. Por outro lado, amostras de plaquetas tratadas com SNP ou SIN-1 (0,1 e 1 mM) por 60 min não mostraram nitração de proteína nos resíduos de tirosina. No conjunto, estes dados sugerem que o NO inibe a adesão de plaquetas não ativadas e ativadas, por mecanismos dependentes e independentes de GMPc sendo que a nitração da a-actinina 1 plaquetária, parece ser o principal mecanismo responsável pelo componente independente de GMPc. Paralelamente, observamos que em concentrações elevadas, o SIN-1 diminui a viabilidade e a atividade da fosfatase ácida das plaquetas devido à formação de ânion superóxido.Abstract: The inhibition of platelet adhesion to the subendothelium by nitric oxide (NO) is essential in preventing excessive aggregation and thrombus formation The objective of this work was to investigate the mechanisms of the NO on inhibition of human platelet adhesion looking for identify of the cGMP-dependent and independent mechanisms Adhesion assay was carried out in the 96-well microtiter plates coated by fibrinogen, using washed platelet (1,2 x 108 plaquetas/mL) from healthy volunteers. Depending on the experimental protocols, non activated or thrombin (50 mU7ml_)-activated platelets were incubated with NO donors (SNP or SIN-1), guanylyl cyclase inhibitor (ODQ), O2" scavenger (SOD) and -(-) epigallocatechin gallate, and allowed to adhere to the wells for either 15 or 60 min at 37°C. Cell toxicity was estimated using the MTT assay by platelets after exposure to NO donors. Nitrated proteins were detected by immunobloting. Purification and identification of them were done by Western blotting analysis and mass spectrometry respectively. Significant platelet adhesion was achieved when non-activated and activated platelets were kept on plates for 15 min or 60. The adhesion was significantly increased when platelets were activated with of thrombin. SNP (0,001 - 1000 nM) inhibited significantly both non-activated and thrombm-stimulated platelet adhesion. The MTT reduction assay showed that the exposure of platelets to SNP (0 1 and 1 mM) caused any toxic effect. Pretreatment of platelets with ODQ nearly abolished SNP (0.1 mM)-mediated cGMP elevation and the inhibition of platelet adhesion, but failed to affect the inhibitory effect of SNP (1 mM) on cell adhesion. Pre-incubation of platelets with SOD, reversed the effect of SNP 1mM. Epigalocatechin gallate did not affect the effect of SNP at 0.1 mM: on the other hand, reduced this effect at 1mM SNP. SIN-1 (0,001 - 100 jiM) concentration-dependently inhibited both non-activated and thrombin-stimulated platelet adhesion. In the higher concentration (1 mM), the SIN-1 inhibited almost all platelet adhesion. Pretreatment of platelets with ODQ markedly reverted the increased the levels of cGMP as well as decreased the inhibition of platelet adhesion by SIN-1 at 0,1 mM. SOD did not change the SIN-1 (0,1 mM)- mediated platelet inhibition, but reverted the platelet inhibition in all another conditions. MTT assay showed that the SIN-1 at 1 mM caused toxic effect in the platelets, and this effect was restored by SOD ECG did not affect the effect of SIN-1, excepted in the small concentration, when the inhibitory effect of thrombin-activated platelets was decreased. Immunobloting indicated the presence of nitrated protein that was recognized as alpha-actinin 1. In conclusion, cGMP-dependent and -independent mechanisms contribute to inhibition of platelet adhesion by NO, and that the a-actinic nitration can be the most important c GMP-independent mechanism. Parallel of this, we observed that the high concentration of SIN-1 decreased the viability and acid phosphatase activity by formation of superoxide anion.DoutoradoDoutor em Farmacologia[s.n.]Antunes, Edson, 1960-Lopes, Lucia RossettiKrieger, Marta HelenaCondino Neto, AntonioDonato, Jose LuizUniversidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências MédicasPrograma de Pós-Graduação em FarmacologiaUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASCardoso, Marcia Helena Miranda20062006-02-17T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf149p. : il.https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602657CARDOSO, Marcia Helena Miranda. Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria: mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclico. 2006. 149p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602657. Acesso em: 14 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/368002porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T04:31:57Zoai::368002Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T04:31:57Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
dc.title.none.fl_str_mv Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria : mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclico
Effect of nitric oxide on platelet adhesion : cyclic GMP dependent and independent mechanisms
title Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria : mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclico
spellingShingle Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria : mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclico
Cardoso, Marcia Helena Miranda
Óxido nítrico
Adesividade plaquetaria
Inibidores da agregação de plaquetas
Doadores de óxido nítrico
Nitroprussiato
Nitric oxide
Platelet adhesiveness
Platelet agregatuin inhibitors
Nitric oxide donors
Nitroprusside
title_short Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria : mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclico
title_full Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria : mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclico
title_fullStr Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria : mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclico
title_full_unstemmed Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria : mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclico
title_sort Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria : mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclico
author Cardoso, Marcia Helena Miranda
author_facet Cardoso, Marcia Helena Miranda
author_role author
dc.contributor.none.fl_str_mv Antunes, Edson, 1960-
Lopes, Lucia Rossetti
Krieger, Marta Helena
Condino Neto, Antonio
Donato, Jose Luiz
Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas
Programa de Pós-Graduação em Farmacologia
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
dc.contributor.author.fl_str_mv Cardoso, Marcia Helena Miranda
dc.subject.por.fl_str_mv Óxido nítrico
Adesividade plaquetaria
Inibidores da agregação de plaquetas
Doadores de óxido nítrico
Nitroprussiato
Nitric oxide
Platelet adhesiveness
Platelet agregatuin inhibitors
Nitric oxide donors
Nitroprusside
topic Óxido nítrico
Adesividade plaquetaria
Inibidores da agregação de plaquetas
Doadores de óxido nítrico
Nitroprussiato
Nitric oxide
Platelet adhesiveness
Platelet agregatuin inhibitors
Nitric oxide donors
Nitroprusside
description Orientador: Edson Antunes
publishDate 2006
dc.date.none.fl_str_mv 2006
2006-02-17T00:00:00Z
dc.type.status.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/publishedVersion
dc.type.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/doctoralThesis
format doctoralThesis
status_str publishedVersion
dc.identifier.uri.fl_str_mv https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602657
CARDOSO, Marcia Helena Miranda. Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria: mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclico. 2006. 149p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602657. Acesso em: 14 mai. 2024.
url https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602657
identifier_str_mv CARDOSO, Marcia Helena Miranda. Efeito inibitorio do oxido nitrico na adesão plaquetaria: mecanismos dependentes e indepentes de GMP ciclico. 2006. 149p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1602657. Acesso em: 14 mai. 2024.
dc.language.iso.fl_str_mv por
language por
dc.relation.none.fl_str_mv https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/368002
dc.rights.driver.fl_str_mv info:eu-repo/semantics/openAccess
eu_rights_str_mv openAccess
dc.format.none.fl_str_mv application/pdf
149p. : il.
dc.publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
publisher.none.fl_str_mv [s.n.]
dc.source.none.fl_str_mv reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron:UNICAMP
instname_str Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
instacron_str UNICAMP
institution UNICAMP
reponame_str Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
collection Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.name.fl_str_mv Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
repository.mail.fl_str_mv sbubd@unicamp.br
_version_ 1799138412753584128

Registros relacionados