Purificação e caracterização da fosfotirosina proteina fosfatase de baixa massa molecular relativa do figado de carneiro

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Buzalaf, Marilia Afonso Rabelo
Data de Publicação: 1999
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)
Texto Completo: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1588431
Resumo: Orientador: Eulazio Mikio Taga
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spelling Purificação e caracterização da fosfotirosina proteina fosfatase de baixa massa molecular relativa do figado de carneiroFosfatase ácidaEnzimasCinetica de enzimasOrientador: Eulazio Mikio TagaTese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de BiologiaResumo: A PTP de BMr do fígado de carneiro foi purificada 1350 vezes até a homogeneidade, com rendimento de 2,6%, através de um procedimento envolvendo fracionamento com sulfato de amônio, diálise, cromatografia de troca iônica em SP-Sephadex com eluição por íon afinidade e cromatografia de exclusão molecular. Os critérios de pureza utilizados foram a AE, P AGE, SDSPAGE e filtração em gel (Superdex HR 200). A enzima purificada (AE de 81,18 µmol min-1 mg-1) é composta por uma cadeia polipeptídica simples e possui Mr de 17,4 e 18,3 kDa, como determinado através de filtração em gel e SDS-PAGE, respectivamente. O estudo do efeito do pH na atividade enzimática revelou que o pH ótimo é em tomo de 5,5. A enzima apresentou uma atividade máxima a 50°C. A energia de ativação para a hidrólise do pNPP, determinada pelo gráfico de Arrhenius, foi de 49,674 kJ mol-1. A adição de BSA (0,1 a 0,75 mg/mL) ao meio de reação enzimática promoveu um incremento de até 40% na atividade enzimática, sendo que concentrações maiores tiveram pouco efeito. Já a adição de BSA ao meio de diluição enzimática elevou a velocidade em até 350%, tendo provocado um ligeiro aumento na Km, praticamente sem interferir com a Ea. A atividade da enzima foi pouco sensível a diversos compostos e íons metálicos, exceto pela ativação por guanosina e inibição por SDS, ácido úrico, Ag+, Hg+, CU2+ e Zn2+. O estudo de inibidores demonstrou insensibilidade ao tartarato e fluoreto e inibição por vanadato (Ki de 0,097µM), fosfato inorgânico (Ki de 0,94 mM), molibdato de amônio (Kic de 12,8 µM e Kia de 2,7 µM) e pCMB. Dos substratos testados, apenas pNPP, ß-Naftil-P, Tyr-P e FMN foram hidrolisados significativamente, com Km de 0,151, 0,726, 3,873e 0,12 mM, no pH 5,0 e 1,861, 4,447, 5,673 e 0,11 mM no pH 7,0, respectivamente. Também houve hidrólise sobre o acetil-P (Km de 0,18 mM) no pH 5,0, entretanto com uma velocidade 100 vezes menor em relação ao pNPPAbstract: A low molecular weight sheep liver phosphotyrosine protein phosphatase was purified 1350-fold to homogeneity, with 2.6% recovery, by a procedure involving ammonium sulfate fractionation, dialysis, SP-Sephadex ion-exchange chromatography with ion-affinity elution and molecular exclusion chromatography. The following homogeneity criteria were used: specific activity, P AGE, SDS-P AGE and gel filtration (Superdex HR 200). The purified enzyme (specific activity 81,18 µmol min-1 mg-l) contained a single peptide chain and had a relative molecular mass of 17.4 and 18.3 kDa, as determined by gel filtration chromatography and SDS-PAGE, respectively. pNPP hydrolysis cata1yzed by this enzyme had a pH optimum of 5.5 and maximal activity at 50°C. An activation energy value of 49.674 kJ mol-1 for the reaction of pNPP hydrolysis was determined from Arrhenius plot. Addition of BSA (0.1 to 0.75 mg/mL) to enzyme reaction media increased unti140% enzyme activity, but higher concentrations of BSA had a small effect. Addition of BSA to enzyme dilution media increased velocity until 350%, causing a slight increase in Km, without interfering in activation energy. Different compounds and meta1lic ions did not significant1y affect enzyme activity, except for inhibition by SDS, uric acid, Ag+, Hg+,Cu2+ and Zn2+ and activation by guanosine. Enzyme was also inhibited by vanadate (Ki, 0.097 µM), inorganic phosphate (Ki 0.94 µM), ammonium molybdate (Kic, 12.8 µM and Kia, 2.7 µM) and pCMB. Both tartrate and fluoride were very weak inhibitors. Apparent Km values obtained, at 37°C were 0.151, 0.726, 3.873 and 0.12 mM at pH 5.0 and 1.861, 4.447, 5.673 and 0.11 mM, at pH 7.0, for pNPP, ßNaftil-P, Tyr-P and FMN, respectively. Acetyl-P was also hydrolyzed CKm, 0,18 mM) at pH 5.0, but the velocity was 100 times smaller in respect to pNPPDoutoradoBioquímicaDoutor em Biologia Funcional e Molecular[s.n.]Taga, Eulazio MikioAoyama, HiroshiNovello, Jose CamilloTarzia, OlindaLara, Vanessa SoaresUniversidade Estadual de Campinas. Instituto de BiologiaPrograma de Pós-Graduação em Biologia Funcional e MolecularUNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINASBuzalaf, Marilia Afonso Rabelo19991999-11-26T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisapplication/pdf113p. : il.(Broch.)https://hdl.handle.net/20.500.12733/1588431BUZALAF, Marilia Afonso Rabelo. Purificação e caracterização da fosfotirosina proteina fosfatase de baixa massa molecular relativa do figado de carneiro. 1999. 113p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: https://hdl.handle.net/20.500.12733/1588431. Acesso em: 14 mai. 2024.https://repositorio.unicamp.br/acervo/detalhe/185883porreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instname:Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)instacron:UNICAMPinfo:eu-repo/semantics/openAccess2017-02-18T03:05:28Zoai::185883Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttp://repositorio.unicamp.br/oai/tese/oai.aspsbubd@unicamp.bropendoar:2017-02-18T03:05:28Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) - Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP)false
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