Desenvolvimento e validação de ensaio de RT-qPCR multiplex para detecção e diferenciação dos subtipos do vírus influenza A (H1/H3, N1/N2) circulantes em suínos no Brasil

• Autor(a) principal: Haach, Vanessa
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/195797
• topic: Diagnostico molecular; Variação antigênica; Vírus da influenza A; Suínos; Brasil; Influenza A virus; Rapid diagnosis; Multiplex RT-qPCR; Subtyping; Swine

A influenza é uma doença respiratória viral aguda que afeta várias espécies de aves e mamíferos, incluindo o homem. A doença em suínos é causada pelo vírus influenza A (IAV), tendo um impacto econômico significativo nos rebanhos suínos afetados, além de representar uma ameaça à população humana devido ao seu potencial pandêmico e zoonótico. Muito embora os subtipos virais globalmente prevalentes em suínos sejam o H1N1, H1N2 e H3N2, estes são geneticamente e antigenicamente distintos, de acordo com a região geográfica de origem. Estudos recentes realizados com isolados do IAV de suínos confirmaram que as linhagens virais detectadas no Brasil são restritas ao território brasileiro, não sendo encontrados vírus semelhantes em suínos de outros países. Desta forma, um teste de diagnóstico rápido, que seja capaz de detectar e diferenciar o subtipo do IAV em suínos é importante para o monitoramento e controle da infecção em rebanhos suínos. Além disto, no Brasil não existem testes rápidos disponíveis comercialmente, como RT-qPCR para subtipar o IAV em amostras clínicas de suínos. Assim, este estudo teve como objetivo desenvolver e validar dois ensaios de RT-qPCR multiplex (um para a hemaglutinina viral – H1pdm, H1hu, H3; e outro para a neuraminidase viral – N1pdm, N1hu, N2) para a detecção e diferenciação dos subtipos H1N1, H1N2 e H3N2 do IAV circulantes em suínos no Brasil. A especificidade analítica da técnica foi de 100%, na correta identificação do subtipo e linhagem viral em 85 IAVs previamente caracterizados por sequenciamento genômico. O ensaio apresentou 100% de especificidade diagnóstica em 50 amostras negativas para o IAV e positivas para outros patógenos de suínos. O limite de detecção da RT-qPCR variou entre 5,09x103 e 5,09x101 cópias de RNA viral/μL, conforme o gene avaliado. Posteriormente, 73 amostras clínicas de suínos positivas para o IAV por RT-PCR (gene da matriz) foram testadas. A RT-qPCR multiplex identificou o subtipo e a linhagem viral em 74% das amostras clínicas analisadas, sendo que o subtipo H3N2 de origem humana (46,3%) foi o mais detectado, seguido pelo H1N1 de origen pandêmica (33,3%), H1N2 de origem humana (11,1%) e HxN1pdm (3,7%). Além disto, coinfecções (3,7%) e vírus que sofreram rearranjo gênico (1,9%) foram detectados. Portanto, o ensaio de RT-qPCR multiplex desenvolvido e validado neste estudo mostrou-se um método rápido, muito sensível e específico para a identificação dos subtipos e linhagens do IAV em amostras de suínos. A técnica descrita é economicamente viável quando comparada a outros métodos, como o sequenciamento genômico, e uma vez implementada em laboratórios de diagnóstico, poderá fornecer informações sobre a prevalência dos subtipos virais em suínos, contribuindo para o monitoramento e vigilância da influenza em rebanhos suínos.