Avaliação da expressão gênica e da maturação nuclear in vitro em complexos cumuli-oócitos bovinos

• Autor(a) principal: Velho, Fernanda Araújo de Britto
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS
• Texto Completo: http://hdl.handle.net/10183/34778
• topic: Reprodução animal : Bovinos; Expressão gênica; Maturação in vitro; Cumulus cells; Gene expression; In vitro maturation

Dentre os principais desafios que persistem no campo da biologia da reprodução está a compreensão da natureza dos processos celulares e moleculares que determinam a qualidade dos oócitos. Um dos fenômenos a serem melhor compreendidos é a aquisição da competência do oócito, e qual o papel desempenhado pelo ambiente folicular que circunda o gameta no seu potencial de desenvolvimento. As células foliculares, especialmente as células do cumulus, certamente desempenham um papel fundamental na aquisição da competência de oócitos in vivo. Durante a maturação in vitro (MIV) do oócito observa-se expansão e mucificação das células da granulosa que formam o complexo cumulus oophorus-oócito (CCO), em função da intensa síntese de componentes da matriz extracelular. Essas modificações no aspecto do cumulus são utilizadas como indicativo da ocorrência de maturação oocitária e contribuem para que ocorra a fecundação. A expressão de proteínas associadas à matriz extracelular das células do cumulus pode estar sob influência de fatores de origem oocitária, e também pode estar relacionada à composição do meio de MIV. Os objetivos deste trabalho foram: 1) avaliar a expressão dos transcritos dos genes que codificam para as proteínas ácido hialurônico sintase 2 (HAS2), link protein 1 (HAPLN1), conexina 43 (GJA1) e b-actina (ACTB) em complexos cumuli-oócitos (CCOs) bovinos não maturados, e submetidos à maturação in vitro em meios com diferentes suplementações protéicas; e 2) avaliar as taxas de maturação nuclear dos oócitos submetidos às diferentes condições de MIV. Os CCOs foram obtidos a partir de ovários coletados de fêmeas bovinas logo após o abate, selecionados morfologicamente e distribuídos em três grupos experimentais: G1: CCOs não maturados; G2: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com soro fetal bovino (SFB); G3: CCOs submetidos à MIV em meio TCM suplementado com albumina sérica bovina (BSA). A MIV foi realizada em a 39oC, 5% de CO2 e máxima umidade relativa, por 22 a 24 horas. Para a extração do RNA total das amostras de CCOs foi utilizado o reagente TRIzol®. O RNA total foi submetido à captação específica do mRNA através de separação magnética (Dynabeads® mRNATM DIRECT Micro Kit). Os mRNAs foram transcritos reversamente em cDNA utilizando-se a técnica de RT-PCR, para avaliar os padrões de expressão dos transcritos. Parte dos oócitos dos grupos G2 e G3 foi desnudada das células do cumulus, e submetida à coloração com Hoechst 33342, para avaliação da maturação nuclear. A análise dos resultados de abundância relativa dos mRNAs de interesse mostrou diferença significativa entre os diferentes grupos testados para os transcritos de HAS2 (p=0,000), link protein 1 (p=0,001), conexina 43 (p=0,007) e b-actina (p=0,011), sendo maior nos grupos de CCOs submetidos à MIV em meio suplementado com SFB. A avaliação da morfologia nuclear não mostrou diferenças significativas entre as taxas de maturação nos grupos G2 e G3. Pode-se concluir que a exposição de CCOs bovinos à diferentes condições de MIV influenciou a expressão dos transcritos de HAS2, link protein 1, conexina 43 e b-actina. Entretanto, a MIV em presença de SFB ou BSA não mostrou diferença nas taxas de retomada da meiose e de maturação nuclear.