Contribuição dos subdomínios (β/α)4 para a estabilidade e atividade de β-glicosidases GH1 com estrutura (β/α)8 barril

• Autor(a) principal: Maira Artischeff Frutuoso
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP
• Texto Completo: https://doi.org/10.11606/T.46.2019.tde-25112019-162943

Domínios são definidos como unidades de dobramento independente e estáveis que formam a estrutura das proteínas (Richardson, 1981; Dootlitle, 1995; Porter e Rose, 2012). Interessantemente quando esta definição é aplicada na análise de proteínas com dobramento (β/α)8 barril identificam-se 2 domínios, que correspondem as suas metades N- e C-terminais (Porter e Rose, 2012), contrastando com a visão que assume o (β/α)8 barril como um domínio único. Deste modo, considerando então que as metades N-terminal e C-terminal das proteínas (β/α)8 barril sejam consideravelmente estáveis e independentes, o objetivo geral desta tese foi avaliar como as propriedades individuais destes subdomínios (β/α)4 se combinam e definem tanto a estabilidade quanto a atividade catalítica das β-glicosidases GH1, que possuem estrutura (β/α)8 barril. As β-glicosidases bglA de Thermotoga marítima (uma bactéria termófila), bglA e bglB de Paenibacillus polymyxa (uma bactéria mesófila) e proteínas quiméricas originadas da combinação dos subdomínios (β/α)4 entre duas destas β-glicosidases (NbglThm-CbglB, NbglB-CbglThm, NbglThm-CbglA, NbglA-CbglThm, NbglA-CbglB e NbglB-CbglA) foram os modelos experimentais. As β-glicosidases bglA, bglB e bglThm foram produzidas como proteínas recombinantes e purificadas. Apenas NbglA-CsbglThm pode ser purificada solúvel e ativa. A fluorescência de triptofanos e o dicroísmo circular sugerem que as β-glicosidases selvagens e a quimera estão enoveladas. Além disso, NbglA-CbglThm apresenta uma composição de estrutura secundária mais próxima à bglA do que bglThm. Por outro lado, o acesso do supressor acrilamida aos triptofanos de NbglA-CbglThm é igual a bglThm e menor do que bglA. A Tm e o Kobs de inativação a 47°C de NbglA-CbglThm são intermediárias àquelas de bglA e bglThm. Portanto, a termoestabilidade da quimera é uma ponderação daquela das suas proteínas parentais. NbglA-CbglThm possui atividade enzimática independente do pH, enquanto bglA e bglThm exibem uma curva em sino. Ainda, NbglA-CbglThm mostrou menor atividade enzimática, ilustrada pela queda dos kcat para os substratos estudados. Considerando que funcionamento do sítio ativo das β-glicosidases depende do posicionamento relativo de pelo menos dez resíduos, estas mudanças na quimera não são inesperadas. NbglA-CbglThm possui Km intermediário para os substratos pNPβ- Gluco e pNPβ-Fuco em relação a bglA e bglThm. Adicionalmente, a especificidade pelo substrato de NbglA-CbglThm é uma ponderação daquela de bglA e bglThm, pois enquanto estas parentais exibiram preferência por um destes substratos, a quimera apresenta o mesmo kcat/Km para os dois. Deste modo, a caracterização da atividade enzimática sugere que as metades (β/α)4 que compõem a quimera NbglA-CbglThm provavelmente se dobraram autossuficientemente e se ajustaram formando um sítio ativo funcional. Coerentemente, a estabilidade térmica intermediária da quimera também sugere que as metades (β/α)4 das proteínas parentais mantiveram sua termoestabilidade relativamente independente. Em conjunto estas observações implicam em razoável estabilidade e independência termodinâmica no dobramento de cada uma das metades (β/α)4, funcionando, portanto, como unidades praticamente independentes, ou seja, como domínios.