Utiliza????o de altas press??es hidrost??ticas para o estudo e renatura????o de prote??nas com estrutura quatern??ria

• Autor(a) principal: RODRIGUES, DANIELLA
• Data de Publicação: 2012
• Tipo de documento: Dissertação
• Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
• Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/10161
• topic: proteins; bacteria; escherichia coli; inclusions; hydrostatics; pressurization

A produ????o de prote??nas recombinantes ?? uma ferramenta essencial para a ind??stria biotecnol??gica e suporta a expans??o da pesquisa biol??gica moderna. Uma variedade de hospedeiros pode ser utilizada para produzir estas prote??nas e dentre eles, as bact??rias E. coli s??o as hospedeiras mais utilizadas. No entanto, a express??o heter??loga de genes em E. coli frequentemente resulta em um processo de enovelamento incompleto que leva ao ac??mulo de agregados insol??veis, conhecidos como corpos de inclus??o (CI). Altas press??es hidrost??ticas s??o capazes de desfavorecer intera????es intermoleculares hidrof??bicas e eletrost??ticas, levando ?? dissocia????o dos agregados e por isso s??o ??teis para solubilizar e renaturar prote??nas agregadas em CI. O presente trabalho teve como objetivo o estudo do processo de desagrega????o dos CI e de renatura????o das prote??nas oligom??ricas subunidade B da toxina col??rica (CTB) e regi??o globular da fibra adenoviral (RGFA) utilizando altas press??es hidrost??ticas. A toxina col??rica (CT) ?? composta por uma subunidade A e cinco subunidades B combinadas em uma holotoxina AB5. A CTB ?? a por????o pentam??rica n??o t??xica da CT, respons??vel pela liga????o da holotoxina ao receptor ganglios??deo GM1. A fibra do adenov??rus ?? uma prote??na homotrim??rica que forma parte do caps??deo viral, organizada em tr??s regi??es: a cauda N-terminal, a haste central e a regi??o C-terminal (regi??o globular). A RGFA se liga ?? prote??na de membrana CAR nas c??lulas hospedeiras e promove a internaliza????o do v??rus. Os estudos apresentados neste trabalho demonstraram que a alta press??o hidrost??tica foi eficaz na desagrega????o dos CI da CTB e da RGFA. As condi????es de renatura????o foram otimizadas utilizando-se diferentes propor????es do par redox glutationa oxidada e reduzida, concentra????es de agentes caotr??picos, presen??a de aditivos e esquemas diferenciados de compress??o/descompress??o daqueles previamente descritos na literatura. CTB sol??vel e pentam??rica foi obtida pela compress??o da suspens??o de CI a 2,4 kbar por 16 horas em tamp??o TrisHCl 50 mM pH 8,5, 1 mM de tween 20 e descompress??o direta seguida de incuba????o em press??o atmosf??rica. O rendimento de renatura????o da CTB sol??vel e pentam??rica foi de at?? 45 % e 288 mg de CTB/litro de cultura bacteriana. Esta prote??na apresentou estrutura regular e atividade biol??gica. RGFA trim??rica foi obtida pela compress??o da suspens??o de CI em tamp??o TrisHCl 50 mM pH 8,0 e 0,5 M de L-arginina a 2,4 kbar por 1,5 horas e 0,4 kbar por 16 horas antes da completa descompress??o. O rendimento de prote??na sol??vel trim??rica da RGFA foi de 4 %, por??m n??o foi poss??vel obter a atividade biol??gica desta prote??na.