Degradação de gossipol por macrofungos e análise do secretoma de Panus lecomtei durante crescimento em caroço de algodão

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Soares Neto, Clemente Batista
Data de Publicação: 2019
Tipo de documento: Tese
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da UnB
Texto Completo: https://repositorio.unb.br/handle/10482/37395
Resumo: Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.
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spelling Soares Neto, Clemente BatistaSiqueira, Félix Gonçalves deMiller, Robert Neil Gerard2020-04-08T12:01:48Z2020-04-08T12:01:48Z2020-04-082019-07-26SOARES NETO, Clemente Batista. Degradação de gossipol por macrofungos e análise do secretoma de Panus lecomtei durante crescimento em caroço de algodão. 2019. 208 f., il. Tese (Doutorado em Biologia Molecular)—Universidade de Brasília, Brasília, 2019.https://repositorio.unb.br/handle/10482/37395Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2019.A torta de caroço de algodão (TCA) é um abundante subproduto obtido de agroindústrias, rico em proteínas. Entretanto, sua aplicação na nutrição de animais monogástricos é limitada pela presença de gossipol livre (GL), uma substância tóxica. Alguns fungos basidiomicetos são capazes de degradar TCA quando cultivados em fermentação em estado sólido (FES), secretando enzimas hidrolíticas e lignolíticas. Neste estudo, o potencial de macrofungos na degradação de GL foi avaliado e proteínas potencialmente envolvidas na biodestoxificação desse fator antinutricional foram identificadas. Para detectar de forma precisa o GL em baixos níveis, foi desenvolvido um método em cromatografia líquida de ultra eficiência (UHPLC) para quantificar GL em diferentes amostras. Os limites de detecção e quantificação foram observados em 0,2 e 0,5 μg/mL, respectivamente, com boa reprodutibilidade, precisão (RSD-Relative Standard Deviation) <10% e recuperação superior a 94%. Empregando-se esse método foi possível selecionar diferentes macrofungos capazes de degradar GL quando cultivados em FES. Os macrofungos promissores foram Pleurotus ostreatus (CC389), Pleurotus sapidus (CC28), Panus lecomtei (CC40), Ganoderma lucidum (CC351) e Pycnoporus sanguineus (CC400). Em outro momento, foram comparados diferentes métodos de pré-tratamento para redução de GL em caroço de algodão. Um tratamento químico com Ca(OH)2 eliminou 99,9% do GL; a pré- compostagem biológica reduziu o GL em 99% após seis dias, e um método físico (autoclavagem) em 96,3% após exposição de 60 minutos. Um pré-tratamento utilizando um método combinado de autoclavagem seguida de FES por macrofungos, forneceu maiores níveis de reduções do que os mencionados acima, como também ofereceram melhorias nutricionais nas características do substrato final obtido, elevando os teores de proteína total e reduzindo lipídios totais. O substrato colonizado com os macrofungos P. ostreatus e P. lecomtei foi analisado quanto à presença de enzimas lacases e manganês peroxidase secretadas por fungos em um período de incubação de 15 dias. Na segunda etapa, P. lecomtei foi selecionado e novamente inoculado nas biomassas: caroço de algodão (CAT) tratado por autoclavagem e caroço de algodão tratado com Ca (OH)2 (CAT-TR). Extratos brutos (EBs) foram obtidos a partir de cada cultivo e foram testados quanto à capacidade em degradar gossipol sintético (gossipol acetato) e inibidores enzimáticos derivados da lignina. Foi observada degradação total do gossipol sintético em apenas 60 minutos de incubação com degradação de inibidores enzimáticos, com destaque para o EB derivado de CAT-TR, com degradação de até 95% de ácido sinápico ao final de 240 minutos de incubação. Foram utilizadas abordagens proteômicas com o intuito de caracterizar o perfil do secretoma desses EBs (obtidos após seis e 12 dias de cultivo), por LC-MS/MS. Diferentes perfis protéicos foram identificados de acordo com o tipo de pré-tratamento empregado na biomassa bem como em função dos tempos de cultivo. Sendo assim, é provável que diferentes proteínas estejam envolvidas na sobrevivência do fungo e também na degradação de compostos tóxicos como o gossipol. As proteínas/enzimas com potencial biotecnológico obtidas dos EBs incluíram as lacases, peroxidases, oxidoredutases, heat shock proteins, metaloproteases, glucanases e citocromo b5, que atuam em vias envolvidas na oxidação de substratos, destoxificação de fatores tóxicos, estresse oxidativo, como quelantes de metais, degradação de lignina e respiração celular. A produção dessas enzimas pode ter ocorrido devido à presença do gossipol, com participação destas na biodestoxificação de GL, potencializando o uso de CAT na nutrição de animiais monogástricos. Em resumo, os resultados deste estudo demonstraram eficiente degradação de GL por ação de diferentes abordagens econômicas e não poluentes. Os mecanismos enzimáticos envolvidos na degradação de GL foram investigados, com P. lecomtei apresentando considerável capacidade de produzir enzimas para a degradação de GL assim como da parede celular vegetal, com significativo potencial biotecnológico.Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES).Cottonseed cake (CSC), an abundant byproduct obtained from agribusinesses, is rich in proteins. Application in monogastric animal nutrition, however, is limited, due to the presence of free gossypol (FG), a toxic substance. Certain basidiomycete fungi are able to process CSC when cultured in solid state fermentation (SSF), secreting hydrolytic and lignolytic enzymes. In this study, the potential of different macrofungi in transforming FG was evaluated, with proteins potentially involved in biodetoxification of this antinutritional factor identified. In order to accurately detect trace levels of FG, a method based on ultra-high performance liquid chromatography (UHPLC) was developed to quantify FG in different samples. Limits of detection and quantification were observed at 0.2 and 0.5 μg/mL respectively, with good reproducibility, precision (RSD - Relative Standard Deviation) <10%, and recovery above 94%. Employing this detection method, it was possible to select different macrofungi capable of degrading FG when cultivated in SSF. Promising macrofungi comprised Pleurotus ostreatus (CC389), Pleurotus sapidus (CC28), Panus lecomtei (CC40), Ganoderma lucidum (CC351), and Pycnoporus sanguineus (CC400). Later, different pretreatment methodologies for FG reduction in cottonseed were compared. A chemical treatment with Ca(OH)2 eliminated 99.9% of FG; biological pre-composting reduced free gossypol by 99% after 6 days, and a physical method (autoclaving) by 96,3% after 60 minutes. Pre- treatment employing a combined method of autoclaving followed by SSF by macrofungi resulted in greater levels of reduction than the above treatments, as well as improving nutritional characteristics of the final substrate, raising total protein levels and reducing total lipids. Substrate colonized with the macrofungi P. ostreatus and P. lecomtei was analysed for the presence of fungal-secreted laccases and manganese peroxidase enzymes over a 15 day incubation period. In a second step, P. lecomtei was selected and again inoculated onto the biomasses: cottonseed (CS) treated by autoclaving and cottonseed treated with Ca (OH)2 (CS-TR). Crude extracts (CEs) were obtained from each culture and tested for the ability to degrade synthetic gossypol (gossypol acetate) and inhibitors derived from lignin. Total degradation of synthetic gossypol was observed after only 60 minutes incubation, with inactivation of enzymatic inhibitors also detected, highlighting the CEs originating from CS-TR, with degradation of up to 95% of synapic acid after 240 minutes incubation. Proteomic approaches were applied to characterize the secretome profile of these CEs (obtained following 6 and 12 days of culture) by LC-MS/MS. Different protein profiles were identified according to the type of biomass pretreatment applied as well as the time of cultivation. Different proteins are likely involved in fungal survival and also in degradation of toxins such as gossypol. Proteins/enzymes of biotechnological potential obtained from the CEs included laccases, peroxidases, oxidoreductases, shock proteins, metalloproteases, glucanases and cytochrome b5, which act in pathways involved in oxidation of substrates, detoxification of toxic factors, oxidative stress, in metal chelation, lignin degradation and cellular respiration. The production of such enzymes may be due to the presence of gossypol, with their participation in FG detoxification potentializing CSC use for monograstic animal nutrition. In summary, the findings of this study demonstrated efficient FG degradation using different economical, non- polluting approaches. Investigation of enzymatic mechanisms involved in FG degradation were investigated, with P. lecomtei exhibiting considerable capacity in producing enzymes for both FG and plant cell wall degradation, with relevant biotechnological potential.InglêsporA concessão da licença deste item refere-se ao termo de autorização impresso assinado pelo autor com as seguintes condições:Na qualidade de titular dos direitos de autor da publicação, autorizo a Universidade de Brasília e o IBICT a disponibilizar por meio dos sites www.bce.unb.br, www.ibict.br, http://hercules.vtls.com/cgi-bin/ndltd/chameleon?lng=pt&skin=ndltd sem ressarcimento dos direitos autorais, de acordo com a Lei nº 9610/98, o texto integral da obra disponibilizada, conforme permissões assinaladas, para fins de leitura, impressão e/ou download, a título de divulgação da produção científica brasileira, a partir desta data.info:eu-repo/semantics/openAccessDegradação de gossipol por macrofungos e análise do secretoma de Panus lecomtei durante crescimento em caroço de algodãoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisMacrofungosSecretomaGossipol livreCaroço de algodãoProteomareponame:Repositório Institucional da UnBinstname:Universidade de Brasília (UnB)instacron:UNBLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain676http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/37395/2/license.txt59c0495af143a2dbef8cb1eca992b8cfMD52open accessORIGINAL2019_ClementeBatistaSoaresNeto.pdf2019_ClementeBatistaSoaresNeto.pdfapplication/pdf8771343http://repositorio2.unb.br/jspui/bitstream/10482/37395/1/2019_ClementeBatistaSoaresNeto.pdf326c556df140d961b36abbbb3a45fdabMD51open access10482/373952023-07-07 21:01:01.114open accessoai:repositorio2.unb.br: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Biblioteca Digital de Teses e DissertaçõesPUBhttps://repositorio.unb.br/oai/requestopendoar:2023-07-08T00:01:01Repositório Institucional da UnB - Universidade de Brasília (UnB)false
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