Utilização de um sistema replicon reporter para triagem da atividade antiviral de extratos de plantas e produtos naturais contra SARS-CoV-2

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Costa, Heloisa Alves
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/60671
Resumo: Há necessidade urgente da descoberta de novos compostos antivirais eficazes ampliar o arsenal de medicamentos para o tratamento da COVID-19. Uma das estratégias para a descoberta de fármacos antivirais contra o SARS-CoV-2 é a utilização de sistemas que não utilizam o vírus infeccioso para a triagem de compostos, como os sistemas de replicon repórter. O principal objetivo desse estudo foi implantar, na Fiocruz Minas, um sistema de replicon repórter, denominado BHK-rep-SARS-CoV-2 GLucNeo expresso em células BHK-21, para ser utilizado como plataforma de triagem de extratos, produtos naturais e sintéticos com atividade contra SARS-CoV-2. Neste sistema repórter, os genes das proteínas estruturais virais spike (S), membrana (M) e envelope (E) do SARS-CoV-2 foram excluídos para evitar a formação de partículas virais infecciosas. Esses genes foram substituídos pelos genes Gaussia luciferase (GLuc) e resistência à neomicina (Neo), que são expressos constitutivamente pelo sistema repórter. Usando um ensaio de luciferase, observamos que o sinal da luciferase GLuc, expresso em unidades relativas de luminescência (RLU) medido em células BHK-rep-SARS-CoV-2 foi quatro vezes maior quando comparado às células BHK-21 (sem replicon). Essa diferença foi significativa (p < 0,0012), porém foi considerada inferior às diferenças relatadas por outros usuários. Para avaliar o desempenho do sistema repórter replicon BHK-rep-SARS-CoV-2 para a triagem de compostos contra SARS-CoV-2, analisamos 27 extratos vegetais e fúngicos e oito produtos naturais, incluindo a licorina, um produto natural, como um controle positivo, uma vez que sua ação antiviral foi descrita contra o vírus infeccioso. Em seguida, a expressão da luciferase GLuc de células BHK-rep-SARS-CoV-2 tratadas por 72 horas com concentrações não tóxicas de extratos selecionados e produtos naturais foi quantificada pelo ensaio de luciferase. Nossos resultados mostraram que a licorina e um extrato do bulbo do Hippeastrum puniceum (no qual vários alcaloides inclusive a licorina foram identificados por nosso grupo) foram capazes de reduzir significativamente a expressão da GLuc. No entanto, nossos dados indicaram que há necessidade de adequação de nossas instalações para fornecer melhores leituras do ensaio de luciferase, para que o sistema repórter rep-SARS-CoV-2 GLucNeo possa ser usado satisfatoriamente como uma ferramenta para rastrear a atividade anti-SARS-CoV-2 de bibliotecas de extratos brutos, produtos naturais ou sintéticos.
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spelling Costa, Heloisa AlvesAlves, Tânia Maria AlmeidaOliveira, Jaquelline Germano deAlves, Tânia Maria de AlmeidaAlves, Pedro AugustoRoyo, Vanessa de AndradeOliveira, Jaquelline Germano2023-10-03T16:49:37Z2023-10-03T16:49:37Z2023COSTA, Heloisa Alves. Utilização de um sistema replicon reporter para triagem da atividade antiviral de extratos de plantas e produtos naturais contra SARS-CoV-2. Belo Horizonte: s.n., 2023. 68 p. Dissertação(Mestrado em Ciências da Saúde. Área de concentração: Biologia Celular e Molecular.)-Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/60671Há necessidade urgente da descoberta de novos compostos antivirais eficazes ampliar o arsenal de medicamentos para o tratamento da COVID-19. Uma das estratégias para a descoberta de fármacos antivirais contra o SARS-CoV-2 é a utilização de sistemas que não utilizam o vírus infeccioso para a triagem de compostos, como os sistemas de replicon repórter. O principal objetivo desse estudo foi implantar, na Fiocruz Minas, um sistema de replicon repórter, denominado BHK-rep-SARS-CoV-2 GLucNeo expresso em células BHK-21, para ser utilizado como plataforma de triagem de extratos, produtos naturais e sintéticos com atividade contra SARS-CoV-2. Neste sistema repórter, os genes das proteínas estruturais virais spike (S), membrana (M) e envelope (E) do SARS-CoV-2 foram excluídos para evitar a formação de partículas virais infecciosas. Esses genes foram substituídos pelos genes Gaussia luciferase (GLuc) e resistência à neomicina (Neo), que são expressos constitutivamente pelo sistema repórter. 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Nossos resultados mostraram que a licorina e um extrato do bulbo do Hippeastrum puniceum (no qual vários alcaloides inclusive a licorina foram identificados por nosso grupo) foram capazes de reduzir significativamente a expressão da GLuc. No entanto, nossos dados indicaram que há necessidade de adequação de nossas instalações para fornecer melhores leituras do ensaio de luciferase, para que o sistema repórter rep-SARS-CoV-2 GLucNeo possa ser usado satisfatoriamente como uma ferramenta para rastrear a atividade anti-SARS-CoV-2 de bibliotecas de extratos brutos, produtos naturais ou sintéticos.There is an urgent need for the discovery of new antivirals to expand the arsenal of drugs for the treatment of COVID-19. One of the strategies for antiviral drug discovery against SARS-CoV-2 is the use of systems that can be used under biosafety level 2 conditions do not use the infectious virus to screen compounds, such as reporter replicon systems. The main objective of this study was to implement a reporter replicon system, called BHK-rep-SARS-CoV-2 GLucNeo expressed in BHK-21 cells, to be used as a screening platform of extracts, natural and synthetic products with activity against SARS- CoV-2, at Fiocruz Minas. In this reporter system, genes of the viral structural proteins spike (S), membrane (M) and envelope (E) of SARS-CoV-2 were excluded to avoid the formation of infectious viral particles. Those genes were replaced by the Gaussia luciferase (GLuc) and neomycin resistance (Neo) genes, which are constitutively expressed by the reporter system. By using a luciferase assay, we observed that the signal of the GLuc luciferase, expressed in relative luminescence units (RLU) measured in BHK-rep-SARS-CoV-2 cells was four times higher when compared to the BHK-21 cells (without replicon). This difference was significant (p < 0.0012), however it was considered lower than the ones reported by other users. To assess the performance of the replicon reporter BHK-rep-SARS-CoV-2 system for screening of compounds against SARS-CoV-2, we assayed 27 crude vegetable and fungal extracts and eight natural products, including lycorine, a natural product, as a positive control since its antiviral action has been described against this infectious virus. Then, expression of GLuc luciferase of BHK-rep-SARS-CoV-2 cells treated for 72 hours with distinct nontoxic concentrations of selected extracts and natural products was quantified by luciferase assay. Our results showed that lycorine and a crude extract of the bulb of the Hippeastrum puniceum (in which several alkaloids including lycorine were identified by our group) were able to significantly reduce the GLuc signal. However, our data indicated that there is a much needed adequacy of our facility to afford better readings of the luciferase assay so that the rep-SARS-CoV-2 GLucNeo reporter system can be used satisfactorily as a tool for screening the activityFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brazil.pors.n.Replicon repórter SARS-CoV-2COVID-19Antivirais naturaisLicorinaSARS-CoV-2 reporter repliconCOVID-19Natural antiviralsLycorinReplicon/farmacologiaSars-Cov/químicaAntivirais/farmacologiaCOVID-19/tratamento farmacológicoProdutos naturais / farmacologiaUtilização de um sistema replicon reporter para triagem da atividade antiviral de extratos de plantas e produtos naturais contra SARS-CoV-2info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis2023Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, BrasilMestrado AcadêmicoPrograma de Pós Graduação em Ciências da Saúde. Belo Horizonte, MG, Brasilinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZLICENSElicense.txtlicense.txttext/plain; charset=utf-82991https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/60671/1/license.txt5a560609d32a3863062d77ff32785d58MD51ORIGINALD_2023_Heloisa Alves Costa.pdfD_2023_Heloisa Alves Costa.pdfapplication/pdf1476932https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/60671/2/D_2023_Heloisa%20Alves%20Costa.pdfdfdc59478aaff7a31e4603c3503d4daaMD52icict/606712023-10-03 13:49:39.019oai:www.arca.fiocruz.br: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ório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352023-10-03T16:49:39Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false
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