Micobactérias não-tuberculosas isoladas da Mata Atlântica aspectos genéticos, bioquímicos e identificação de antígenos compartilhados com a vacina BCG

• Autor(a) principal: Emmerick, Leandro Santiago
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/7699
• topic: Vacina BCG; Análise Microbiológica; Micobactérias não Tuberculosas

O gênero Mycobacterium possui mais de 160 espécies, dentre elas importantes patógenos como M. leprae, M. tuberculosis e M. bovis. Embora muito se conheça sobre estes patógenos, poucos estudos se concentraram na caracterização detalhada de micobactérias não-tuberculosas (MNT), que apresentam distribuição ambiental variada e são oligotróficas. Embora muitas sejam consideradas saprófitas, acredita-se que a infecção sub-clínica de animais e humanos esteja subestimada. A infecção por MNT ambientais é considerada como um dos fatores que modulam a resposta protetora conferida pela vacina BCG. Neste contexto, o presente estudo tem como foco a caracterização das MNT de crescimento rápido provenientes da Coleção de Bactérias da Mata Atlântica (CBMA) do IOC/FIOCRUZ, com dois objetivos principais: (1) caracterizar espécies que possam ser utilizadas no desenvolvimento de um novo sistema de expressão de proteínas heterólogas e (2) identificar antígenos e vias metabólicas compartilhadas entre espécies patogênicas e saprófitas. Os isolados obtidos da CBMA/IOC foram cultivados em meios LB contendo Tween 80, sob agitação a 25 °C. Foram geradas curvas de crescimento a partir da leitura da DO a 600 nm de triplicatas biológicas, e determinadas características morfológicas. Diversos testes bioquímicos foram realizados para uma melhor caracterização desses isolados O perfil de secreção de proteínas ao longo do crescimento foi verificado por SDS-PAGE, a presença de proteases secretadas avaliada por zimografia e a presença e atividade de celulases foi verificada através de western blot, zimografia e ensaio enzimático. A capacidade de transformação por DNA plasmidial foi avaliada por eletroporação. Também foram propostos agrupamentos filogenéticos com base na análise de sequências de regiões dos genes 16S rRNA (rrs) e hsp65. Em paralelo, foi verificada por western blot a presença de antígenos micobacterianos comuns, já descritos como tendo papel importante na geração de resposta imune (Mpt64, Mpt70, Mpt83 e antígenos do complexo 85) ou no metabolismo e sobrevivência do M. tuberculosis (GlnA1 e HspX). O perfil de crescimento e as características morfológicas e bioquímicas dos isolados parecem confirmar o agrupamento filogenético proposto. Atividade celulásica foi observada em apenas dois isolados, apesar de todos expressarem esta proteína, e não foi encontrada atividade proteásica no filtrado de cultura nas condições testadas Todos os isolados são transformáveis, mas apresentam diferenças quanto à eficiência e integridade do vetor. As análises por western blot revelaram a presença de proteínas do complexo 85, Mpt70 e GlnA1 e ausência de reatividade para os antígenos Mpt64, Mpt83 e HspX. Desse modo, três isolados foram selecionados para prosseguir com o desenvolvimento do novo sistema de expressão de proteínas heterólogas secretadas. A presença de alguns antígenos compartilhados fornecem novos subsídios para elucidar a relação entre MNT e vacina BCG