Construção de ferramentas moleculares baseadas em CRISPR/Cas9 para a correção da mutação F508del causadora da Fibrose Cística

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Bassai, Letícia Werzel
Data de Publicação: 2021
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/50686
Resumo: A fibrose cística (FC) é uma doença genética, autossômica recessiva causada por mutações no gene CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). A proteína CFTR está presente na membrana apical de células epiteliais e funciona como um canal de íons cloro e bicarbonato mantendo o equilíbrio de água no meio extracelular. Existem mais de 2000 mutações descritas para FC, sendo a mutação F508del a mais comum, com cerca de 70% de prevalência mundial. Atualmente, a doença não tem cura, sendo tratados os principais sintomas, isso faz com que a expectativa de vida seja, em média, 40 anos. Na tentativa de se desenvolver novas abordagens terapêuticas, a técnica de CRISPR/Cas9 se apresenta muito promissora, pois possibilita o reconhecimento e clivagem de uma sequência específica de DNA, ativando pela própria célula o mecanismo de reparo de dano no DNA, que na presença de um DNA com a sequência correta, pode corrigir a mutação. O objetivo deste trabalho é construir ferramentas moleculares para corrigir a mutação F508del de fibrose cística em linhagem celular de epitélio pulmonar (CFBE). O trabalho é dividido em três etapas principais: (1) Construção de ferramentas; (2) Melhora do reparo dirigido por homologia e (3) avaliação da edição. Na primeira etapa foram selecionados desenhos de sgRNA específicos, com softwares de predição, para a mutação F508del do gene CFTR. Os desenhos foram selecionados com base na proximidade da mutação, quantidade e localização de off-targets e eficiência predita in silico. Em sequência, foram construídas as ferramentas moleculares sendo uma baseada no plasmídeo (px458) que contém as sequências do sgRNA, da proteína SpCas9 e do gene RFP. A inserção da sequência do sgRNA no plasmídeo foi confirmada pela técnica de PCR, digestão com enzimas de restrição e sequenciamento. O método de transfecção selecionado foi por agentes lipídicos, apresentando eficiência de cerca 9% na entrada do plasmídeo na célula alvo. A ferramenta construída, ribonucleoproteína, teve o RNA obtido por transcrição in vitro e purificado. Após a formação do complexo com a proteína purificada (SaCas9) esta ferramenta mostrou atividade (30%) em reconhecer e clivar o DNA in vitro. A segunda etapa consistiu em tentar melhorar o reparo dirigido por homologia através da sincronização do ciclo celular, para isto foi selecionada a droga hidroxiureia na concentração de 46,80\03BCg/mL que em 24 horas apresentou sincronização das células (60% na fase G2), porém não foi possível realizar o sorting. A terceira etapa consistiu em testar as ferramentas e avaliar a correção por PCR, qPCR e sequenciamento. Aplicando a metodologia descrita após 48 horas de transfecção das células, foi feita uma triagem por citometria de fluxo e a correção confirmada por técnicas de qPCR, a detecção da correção da mutação F508del foi inferior a 12,5% ou nula, nas condições testadas. Novos ensaios serão realizados com modificação do projeto.
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Atualmente, a doença não tem cura, sendo tratados os principais sintomas, isso faz com que a expectativa de vida seja, em média, 40 anos. Na tentativa de se desenvolver novas abordagens terapêuticas, a técnica de CRISPR/Cas9 se apresenta muito promissora, pois possibilita o reconhecimento e clivagem de uma sequência específica de DNA, ativando pela própria célula o mecanismo de reparo de dano no DNA, que na presença de um DNA com a sequência correta, pode corrigir a mutação. O objetivo deste trabalho é construir ferramentas moleculares para corrigir a mutação F508del de fibrose cística em linhagem celular de epitélio pulmonar (CFBE). O trabalho é dividido em três etapas principais: (1) Construção de ferramentas; (2) Melhora do reparo dirigido por homologia e (3) avaliação da edição. Na primeira etapa foram selecionados desenhos de sgRNA específicos, com softwares de predição, para a mutação F508del do gene CFTR. Os desenhos foram selecionados com base na proximidade da mutação, quantidade e localização de off-targets e eficiência predita in silico. Em sequência, foram construídas as ferramentas moleculares sendo uma baseada no plasmídeo (px458) que contém as sequências do sgRNA, da proteína SpCas9 e do gene RFP. A inserção da sequência do sgRNA no plasmídeo foi confirmada pela técnica de PCR, digestão com enzimas de restrição e sequenciamento. O método de transfecção selecionado foi por agentes lipídicos, apresentando eficiência de cerca 9% na entrada do plasmídeo na célula alvo. A ferramenta construída, ribonucleoproteína, teve o RNA obtido por transcrição in vitro e purificado. Após a formação do complexo com a proteína purificada (SaCas9) esta ferramenta mostrou atividade (30%) em reconhecer e clivar o DNA in vitro. A segunda etapa consistiu em tentar melhorar o reparo dirigido por homologia através da sincronização do ciclo celular, para isto foi selecionada a droga hidroxiureia na concentração de 46,80\03BCg/mL que em 24 horas apresentou sincronização das células (60% na fase G2), porém não foi possível realizar o sorting. A terceira etapa consistiu em testar as ferramentas e avaliar a correção por PCR, qPCR e sequenciamento. Aplicando a metodologia descrita após 48 horas de transfecção das células, foi feita uma triagem por citometria de fluxo e a correção confirmada por técnicas de qPCR, a detecção da correção da mutação F508del foi inferior a 12,5% ou nula, nas condições testadas. Novos ensaios serão realizados com modificação do projeto.Cystic fibrosis (CF) is a genetic, autosomal recessive disease caused by mutations in the CFTR gene (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator). The CFTR protein is present in the apical membrane of epithelial cells and functions as a channel of chlorine and bicarbonate ions maintaining the balance of water in the extracellular medium. In CF patients, mucus is very viscous, which allows it to accumulate on the surface of tissues, especially the lungs. There are more than 2000 mutations described for CF, with the F508del mutation being the most common, with around 70% prevalence worldwide. Currently, the disease has no cure, the main symptoms being treated, this makes life expectancy on average 40 years. In an attempt to develop new therapeutic approaches, the CRISPR/Cas9 technique is very promising, as it allows the recognition and cleavage of a specific DNA sequence, activating the DNA damage repair mechanism by the cell itself, which in the presence of a DNA with the correct sequence, can correct the mutation. The objective of this work is to build molecular tools to correct the F508del mutation of cystic fibrosis in a pulmonary epithelial cell line (CFBE). The work is divided into three main stages: (1) Construction of tools; (2) Improvement of homology-directed repair and (3) edition evaluation. In the first stage, specific sgRNA designs were selected, with prediction software, for the F508del mutation of the CFTR gene. The designs were selected based on the proximity of the mutation, number and location of off-targets and efficiency predicted in silico. In sequence, molecular tools were built, one based on the plasmid (px458) that contains the sequences of the sgRNA, the protein SpCas9 and the RFP gene. The insertion of the sgRNA sequence in the plasmid was confirmed by the PCR technique, digestion with restriction enzymes and sequencing. The transfection method selected was by lipid agents, showing an efficiency of about 9% in the entry of the plasmid into the target cell. The built tool, ribonucleoprotein, had the RNA obtained by in vitro transcription and purified. After the formation of the complex with the purified protein (SaCas9) this tool showed activity (30%) in recognizing and cleaving DNA in vitro. The second step consisted of trying to improve homology-directed repair through cell cycle synchronization, for which the hydroxyurea drug at a concentration of 46.80\03BCg / mL was selected, which in 24 hours showed cell synchronization (60% in the G2 phase), however, it was not possible to perform the sorting, after transfection, due to low cell viability. The third step consisted of testing the tools and evaluating the correction by PCR, qPCR and sequencing. After 48 hours transfection cells, was made a sorting by flow cytometry and the correction confirmed by qPCR techniques, the detection the correction of the F508del mutation was below 12.5% or null, under the conditions tested. New assays will be performed included design modifications for this tool to obtain satisfactory data.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.porConstrução de ferramentas moleculares baseadas em CRISPR/Cas9 para a correção da mutação F508del causadora da Fibrose Císticainfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis2021Instituto Carlos ChagasFundação Oswaldo CruzMestrado AcadêmicoCuritibaPrograma de Pós-Graduação em Biociências e BiotecnologiaCystic FibrosisCRISPR-Associated Protein 9Targeted Gene RepairFibrosis QuísticaProteína 9 Asociada a CRISPRReparación del Gen BlancoMucoviscidoseProtéine-9 associée à CRISPRRéparation génique cibléeFibrose CísticaCRISPR/Cas9Proteína 9 Associada à CRISPRF508delReparo Gênico Alvo-Dirigidoinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZLICENSElicense.txttext/plain1748https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/50686/1/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD51ORIGINAL000248574.pdfapplication/pdf3813886https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/50686/2/000248574.pdf893f0be0e2b4a7b0f9c346d690897473MD52icict/506862022-01-10 12:33:42.379oai:www.arca.fiocruz.br:icict/50686Tk9URTogUExBQ0UgWU9VUiBPV04gTElDRU5TRSBIRVJFClRoaXMgc2FtcGxlIGxpY2Vuc2UgaXMgcHJvdmlkZWQgZm9yIGluZm9ybWF0aW9uYWwgcHVycG9zZXMgb25seS4KCk5PTi1FWENMVVNJVkUgRElTVFJJQlVUSU9OIExJQ0VOU0UKCkJ5IHNpZ25pbmcgYW5kIHN1Ym1pdHRpbmcgdGhpcyBsaWNlbnNlLCB5b3UgKHRoZSBhdXRob3Iocykgb3IgY29weXJpZ2h0Cm93bmVyKSBncmFudHMgdG8gRFNwYWNlIFVuaXZlcnNpdHkgKERTVSkgdGhlIG5vbi1leGNsdXNpdmUgcmlnaHQgdG8gcmVwcm9kdWNlLAp0cmFuc2xhdGUgKGFzIGRlZmluZWQgYmVsb3cpLCBhbmQvb3IgZGlzdHJpYnV0ZSB5b3VyIHN1Ym1pc3Npb24gKGluY2x1ZGluZwp0aGUgYWJzdHJhY3QpIHdvcmxkd2lkZSBpbiBwcmludCBhbmQgZWxlY3Ryb25pYyBmb3JtYXQgYW5kIGluIGFueSBtZWRpdW0sCmluY2x1ZGluZyBidXQgbm90IGxpbWl0ZWQgdG8gYXVkaW8gb3IgdmlkZW8uCgpZb3UgYWdyZWUgdGhhdCBEU1UgbWF5LCB3aXRob3V0IGNoYW5naW5nIHRoZSBjb250ZW50LCB0cmFuc2xhdGUgdGhlCnN1Ym1pc3Npb24gdG8gYW55IG1lZGl1bSBvciBmb3JtYXQgZm9yIHRoZSBwdXJwb3NlIG9mIHByZXNlcnZhdGlvbi4KCllvdSBhbHNvIGFncmVlIHRoYXQgRFNVIG1heSBrZWVwIG1vcmUgdGhhbiBvbmUgY29weSBvZiB0aGlzIHN1Ym1pc3Npb24gZm9yCnB1cnBvc2VzIG9mIHNlY3VyaXR5LCBiYWNrLXVwIGFuZCBwcmVzZXJ2YXRpb24uCgpZb3UgcmVwcmVzZW50IHRoYXQgdGhlIHN1Ym1pc3Npb24gaXMgeW91ciBvcmlnaW5hbCB3b3JrLCBhbmQgdGhhdCB5b3UgaGF2ZQp0aGUgcmlnaHQgdG8gZ3JhbnQgdGhlIHJpZ2h0cyBjb250YWluZWQgaW4gdGhpcyBsaWNlbnNlLiBZb3UgYWxzbyByZXByZXNlbnQKdGhhdCB5b3VyIHN1Ym1pc3Npb24gZG9lcyBub3QsIHRvIHRoZSBiZXN0IG9mIHlvdXIga25vd2xlZGdlLCBpbmZyaW5nZSB1cG9uCmFueW9uZSdzIGNvcHlyaWdodC4KCklmIHRoZSBzdWJtaXNzaW9uIGNvbnRhaW5zIG1hdGVyaWFsIGZvciB3aGljaCB5b3UgZG8gbm90IGhvbGQgY29weXJpZ2h0LAp5b3UgcmVwcmVzZW50IHRoYXQgeW91IGhhdmUgb2J0YWluZWQgdGhlIHVucmVzdHJpY3RlZCBwZXJtaXNzaW9uIG9mIHRoZQpjb3B5cmlnaHQgb3duZXIgdG8gZ3JhbnQgRFNVIHRoZSByaWdodHMgcmVxdWlyZWQgYnkgdGhpcyBsaWNlbnNlLCBhbmQgdGhhdApzdWNoIHRoaXJkLXBhcnR5IG93bmVkIG1hdGVyaWFsIGlzIGNsZWFybHkgaWRlbnRpZmllZCBhbmQgYWNrbm93bGVkZ2VkCndpdGhpbiB0aGUgdGV4dCBvciBjb250ZW50IG9mIHRoZSBzdWJtaXNzaW9uLgoKSUYgVEhFIFNVQk1JU1NJT04gSVMgQkFTRUQgVVBPTiBXT1JLIFRIQVQgSEFTIEJFRU4gU1BPTlNPUkVEIE9SIFNVUFBPUlRFRApCWSBBTiBBR0VOQ1kgT1IgT1JHQU5JWkFUSU9OIE9USEVSIFRIQU4gRFNVLCBZT1UgUkVQUkVTRU5UIFRIQVQgWU9VIEhBVkUKRlVMRklMTEVEIEFOWSBSSUdIVCBPRiBSRVZJRVcgT1IgT1RIRVIgT0JMSUdBVElPTlMgUkVRVUlSRUQgQlkgU1VDSApDT05UUkFDVCBPUiBBR1JFRU1FTlQuCgpEU1Ugd2lsbCBjbGVhcmx5IGlkZW50aWZ5IHlvdXIgbmFtZShzKSBhcyB0aGUgYXV0aG9yKHMpIG9yIG93bmVyKHMpIG9mIHRoZQpzdWJtaXNzaW9uLCBhbmQgd2lsbCBub3QgbWFrZSBhbnkgYWx0ZXJhdGlvbiwgb3RoZXIgdGhhbiBhcyBhbGxvd2VkIGJ5IHRoaXMKbGljZW5zZSwgdG8geW91ciBzdWJtaXNzaW9uLgo=Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352022-01-10T15:33:42Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false
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