Desenvolvimento e Validação de metodologias moleculares para a detecção e quantificação de formas viáveis de Trypanosoma cruzi

• Autor(a) principal: Araujo, Paula Finamore
• Data de Publicação: 2021
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/55383
• topic: Trypanosoma cruzi; Doença de Chagas oral; Viabilidade; qPCR; RT-qPCR; Trypanosoma cruzi; Chagas Disease; qPCR; RT-qPCR; Doença de Chagas; Trypanosoma Cruzi; Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real; Reação em Cadeia da Polimerase Via Transcriptase Reversa

O Trypanosoma cruzi possui um ciclo de vida complexo, se desenvolvendo entre hospedeiros vertebrados e insetos vetores. Além disso, a infecção por T. cruzi por via oral tem se tornado um dos principais mecanismos de transmissão do ponto de vista da saúde pública, principalmente no Brasil. O açaí (Euterpe oleracea e Euterpe precatoria) é atualmente uma das frutas amazônicas mais comercializadas no mercado brasileiro e internacional. Métodos moleculares têm sido desenvolvidos para detecção e quantificação rápida do DNA de T. cruzi, apresentando vantagens em relação à microscopia óptica, considerada o método clássico de diagnóstico em diversas amostras biológicas. No entanto, uma questão recorrente em relação à detecção/quantificação do DNA do T. cruzi está relacionada ao fato de que a amplificação do DNA, em si, não diferencia parasitas viáveis ou mortos. Neste trabalho, padronizamos, a partir do sobrenadante da polpa do açaí estabilizado em um tampão de lise à base de guanidina-EDTA, uma metodologia molecular simples e de alto desempenho, desde a extração de DNA de T. cruzi por colunas de sílica, até a quantificação por qPCR multiplex, com alvo no satDNA de T. cruzi e em um controle interno exógeno. Validamos a metodologia, usando cepas de referência de todas as DTUs de T. cruzi e amostras de polpas de açaí comercializadas no município de Coari/AM, que possui histórico prévio de surto oral da doença de Chagas. A qPCR detectou até 0,01 equivalentes de parasita/mL em açaí e, das 45 amostras comerciais analisadas, 9 (20%) foram positivas para T. cruzi. Visando avaliar o RNA como um marcador de viabilidade de T. cruzi em diferentes tipos de amostras, desenvolvemos uma qPCR com transcrição reversa (RT-qPCR) para quantificar a viabilidade de T. cruzi, em comparação à qPCR com alvo em DNA. Em amostras de intestino do vetor triatomíneo Rhodnius prolixus, a RT-qPCR apresentou linearidades variando de 107 a 102 equivalentes de parasito e de 3 a 0,003 equivalentes de intestino, com eficiências de 100,3% e 102,8% para ambos os alvos, respectivamente. Em relação a R. prolixus infectado experimentalmente observamos uma diminuição da carga parasitária por meio da detecção de mRNA, que não é acompanhada pela quantificação por DNA, principalmente no 15º dia pós-alimentação. Ao avaliar diferentes porções do trato digestivo, por RT-qPCR, detectamos uma redução significativa da carga parasitária no intestino médio anterior de R. prolixus no dia 29 pós-alimentação. Contrariamente, observamos um aumento significativo da carga parasitária no intestino posterior. Além disso, comparando RT-qPCR e qPCR em ensaios de infecção in vitro de carbiomioblastos de rato (linhagem H9C2), confirmamos que o RNA é rapidamente degradado após o tratamento das células infectadas com benznidazol, não sendo mais detectado no dia 1 pós-tratamento. Paralelamente, a detecção de DNA do parasita não apresentou diminuição significativa até 4 dias pós-tratamento (dia 5 pós infecção). No geral, o RNA demonstrou ser um potencial marcador molecular de viabilidade de T. cruzi, e sua avaliação poderá contribuir para o entendimento da dinâmica da infecção, para explorar novas possibilidades de drogas tripanocidas, e em investigações epidemiológicas