Avaliação da especificidade dos primers RV1 e RV2 para o diagnóstico molecular da leishimaniose visceral

• Autor(a) principal: Wanderley, Leandro Batista
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/60902
• topic: Leishmaniose visceral; Reação em Cadeia da Polimerase; Especificidade; Especificidade; Visceral leishmaniasis; Polymerase Chain Reaction; Specificity; DNA primers; leishmaniasis visceral; Reacción en cadena de la polimerasa; Especificidad; cebadores de ADN; Leishmaniose viscérale; Réaction en chaîne par polymérase; Spécificité; Amorces d'ADN; Leishmaniose Visceral; Reação em Cadeia da Polimerase; Sensibilidade e Especificidade; Primers do Dna

A Leishmaniose Visceral (LV) é uma endemia de grande expansão geográfica e, na maioria das áreas endêmicas, co-existe com outras doenças. No Brasil há descrição, em vários municípios, de co-endemias tais como esquistossomose, tuberculose, doença de chagas e leishmaniose tegumentar americana, e estas apresentam manifestações clínicas semelhantes à LV, o que pode interferir na especificidade dos métodos diagnósticos convencionais. O minicírculo do kDNA é o alvo mais estudado e aplicado nas pesquisas da leishmaniose humana. Dentre os primers que tem o kDNA como alvo estão o RV1 e RV2, que já foram aplicados com sucesso em diversas amostras biológicas. Este trabalho teve como objetivo estudar a especificidade dos primers RV1 e RV2, através da técnica de PCR, utilizando DNA de diferentes organismos. Para isto, utilizou-se a ferramenta Primer-BLAST (NCBI), para observar, teoricamente, quais os organismos que possuem regiões para o anelamento dos primers; e, em laboratório, foram testados DNA genômico purificado de diversos organismos. A sensibilidade dos primers foi testada através de uma curva de diluição seriada utilizando o DNA genômico de Leishmania (Leishmania) chagasi para dois sistemas de volumes diferentes. O Sistema de PCR 2, com 50 µL, apresentou uma sensibilidade de 0,1fg, enquanto que o Sistema de PCR 1, com 25 µL, alcançou apenas 1 pg. Testando os primers dos sistemas de forma teórica (Primer-BLAST), estes mostraram-se específicos para Leishmania (Leishmania) major, Leishmania (Leishmania) donovani e Leishmania (Leishmania) infantum. Porém ao testar, em laboratório, o DNA dos organismos com o sistema de PCR 2, observou-se inespecificidade dos primers, que se anelaram frente ao DNA de Schistosoma mansoni e Trypanosoma cruzi, para as mesmas condições de ciclagem. Os resultados encontrados demonstram que os primers RV1 e RV2 não devem ser utilizados em regiões onde estes parasitos estão presentes, pois podem levar a resultados falso-positivos .