Geração de células semelhantes a hepatócitos por reprogramação direta de células-tronco mesenquimais

• Autor(a) principal: Orge, Iasmim Diniz
• Data de Publicação: 2019
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/33150
• topic: Células-tronco mesenquimais; Hepatócitos; Maturação hepática; Reprogramação direta; Mesenchymal stem cells; Hepatocyte; Hepatic maturation; Direct reprogramming

O transplante hepático permanece como o único tratamento eficaz disponível para hepatopatias graves. Entretanto, fatores como a escassez de órgãos viáveis e a rejeição imunológica limitam significativamente este tipo de terapia. O transplante de hepatócitos é uma opção terapêutica em estudo, contudo, a perda de funções metabólicas após técnicas convencionais de cultivo e a inabilidade de proliferar in vitro impedem a reprodução em larga escala deste tipo de procedimento. Devido a estes fatores, uma fonte extra e autóloga de hepatócitos poderia suprir essa carência. Estudos recentes apresentam as células-tronco mesenquimais (CTM) como uma fonte promissora de células hepáticas a partir de reprogramação direta com superexpressão de fatores de transcrição envolvidos no desenvolvimento embrionário hepático. OBJETIVO: O presente estudo visou estabelecer um protocolo para geração de células semelhantes a hepatócitos, do ponto de vista morfológico,fenotípico e funcional, através da reprogramação direta de CTMs. MÉTODOS: A reprogramação hepática foi induzida a partir da superexpressão dos fatores de transcrição FOXA2 e HNF4α através de sistema lentiviral de segunda geração e cultivo das CTM modificadas em meio de indução da diferenciação hepática contendo fatores como HGF, FGF-4 e EGF. As células reprogramadas foram caracterizadas fenotipicamente, ultra-estruturalmente e seu perfil de expressão gênica e propriedades funcionais foram avaliados. Protocolos utilizando cell sorting e pequenas moléculas foram estabelecidos para purificação e maturação da linhagem celular reprogramada. RESULTADOS: Após o cultivo em meio de indução da diferenciação hepática, foi observada a presença de colônias com morfologia epitelial característica de células que expressam marcadores de hepatócitos adultos, tais como albumina,tirosina aminotransferase (TAT) e alfa-1-antitripsina (AAT). A linhagem também apresentou características funcionais como capacidade de estocar glicogênio, lipídios, captação e depuração de indocianina verde, assim como expressão e atividade de enzimas do complexo citocromo P450. A análise ultraestrutural demonstrou características citoplasmáticas semelhantes às de hepatócitos primários como por exemplo o montante de conteúdo mitocondrial. A diferença de conteúdo mitocondrial entre células reprogramadas e CTM foi utilizada para purificação da linhagem por cell sorting. Após a etapa de maturação, foi observada o surgimento de células com aspecto de hepatócitos primários e de células com perfil de colangiócitos. CONCLUSÃO: O protocolo de reprogramação hepática direta desenvolvido mostrou-se eficiente e robusto, gerando células com propriedades hepáticas funcionais que podem ser utilizadas em plataformas de testes de toxicidade de drogas, estudos do desenvolvimento hepático, além de abrir perspectivas de novas alternativas terapêuticas para hepatopatias crônicas e agudas.