Geração in vitro de células dendríticas humanas e sua relação com a vacina BCG Moreau

• Autor(a) principal: Pedro, Thaize Quiroga Chometon
• Data de Publicação: 2016
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/35605
• topic: BCG; moDCs; Ensaio de potência; BCG; moDCs; Potency assay; Vacina BCG; Potência de Vacina; Técnicas In Vitro; Células Dendríticas; Controle de Qualidade

A Tuberculose é considerada uma das principais causas de morte em todo o mundo. A BCG corresponde a única vacina aprovada, apresentando boa relação custo-eficácia para prevenção das formas disseminadas da TB em crianças. Contudo, a proteção fornecida pela mesma é considerada limitada na prevenção de TB pulmonar em adultos. Com relação ao controle de qualidade da produção da BCG, existe uma carência de ensaios laboratoriais. Hoje o ensaio de UFC é utilizado como método de quantificação para as vacinas vivas e como um substituto dos ensaios de potência. Este trabalho propõe um ensaio in vitro utilizando células dendriticas, considerando a primeira linha da resposta imunológica, para avaliação da potência da vacina. Com esse propósito, utilizou-se moDCs diferenciadas in vitro de monócitos isolados de PBMCs. Para o isolamento de monócitos e a diferenciação de moDCs foram testadas difentes técnicas e meios de cultivo, respectivamente. Por fim, a técnica de isolamento por microesferas magnéticas de seleção negativa e positiva e o cultivo e difernciação das células em placa com RPMI e SH e a concentração de 500 UI/ml de cada GMCSF e IL-4. As moDCs imaturas foram infectadas como 3 lotes distintos de BCG (lote A- 6,86 x 106 UFC/ml, lote B- 2,48 x 106 UFC/ml e lote C- 9,82 x 106 UFC/ml) em quatro diluições (1:10, 1:20, 1:40 e 1:60) por 24 horas, Como controle utilizou-se DCs não estimuladas (controle negativo), DCs estimuladas com LPS (controle positivo) e BCG contendo bacilos não viáveis (BGG irradiada e irradiada + aquecida). Após as 24 horas foram avaliados os marcadores de superfície CD14, CD1a, CD209, TLR2 e 4, CD80, CD86, CD40, CD83, HLA-DR e CCR7 por citometria de fluxo. E a partir do sobrenadante das culturas foram dosadas as citocinas pró-inflamatórias IL-12, IL-18, TNF-α, IL-1α e a citocina anti-inflamatória IL-10 por ELISA e feito a contagem de UFC para observação dos bacilos não internalizados pelas moDCs. Como resultado, observou-se uma diminuição na expressão de CD14, um aumento de CD209 enquanto a expressão de CD1a não sofreu alterações quando os monócitos eram diferenciados em moDCs. Já como relação os marcadores CD80, CD86 e HLA-DR, esses apresentaram um aumento de expressão nas células infectadas por BCG na comparação com DCs imaturas, enquanto CD40 apresentou resultados semelhante ou uma diminuição da expressão quando as moDCs foram infectadas por BCG . Não foi observada uma proporcionalidade entre o numero de UFC e a expressão da maioria desses marcadores. Com relação as citocinas, apenas TNF-α apresentou um aumento em seu nível quando as moDCs foram infectadas com BCG, sendo esse aumento proporcional ao numero de UFC e a diluição utilizada. Por fim, com relação a contagem de UFC, mostrou uma menor contagem de bacilos no sobrenadante de moDCs provenientes de seleção positiva. E nesse mesmo grupo, não houve proporcionalidade entes o numero de UFC inicial da BCG e o presente no sobrenadante enquanto nas moDCs provenientes de seleção negativa essa proporção se manteve. Como conclusão a BCG foi capaz de induzir maturação das moDCs in vitro. TNF-α e CD80, mostraram-se como candidatos mais promissores para um futuro ensaio de potência. Entretanto, mais estudos são necessários.