Caracterização funcional de DZIP1 em células de linhagem hela e células-tronco derivadas de tecido adiposo humano

• Autor(a) principal: Shigunov, Patrícia
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/23867
• topic: Complexos Ribonucleoprotéicos; Stem Cells; Gene Expression; Ribonucleoproteins; HeLa Cells; Células-Tronco; Expressão Gênica; Ribonucleoproteínas; Células HeLa

A regulação da expressão gênica em células eucariontes pode ser feita em nível transcricional e pós-transcricional. Em nível pós-transcricional, famílias de proteínas de união ao RNA participam desse processo. Muitos estudos têm apontado a família de proteínas DAZ (Deleted in Azoospermia) como estabilizadora de mRNAs e com um papel central no controle da autorrenovação de células-tronco. DZIP1 (DAZ-interacting protein) é uma proteína capaz de interagir com DAZ em células-tronco embrionárias e germinativas humanas. Em zebrafish, a proteína DZIP1 tem sido descrita como um dos reguladores da via de sinalização Hedgehog (Hh). No entanto, as funções de DZIP1 não foram descritas e há poucos dados sobre os mecanismos em que essa proteína participa. Dessa forma, o presente estudo visa a caracterização funcional de DZIP1 utilizando células HeLa e células-tronco derivadas de tecido adiposo (CTA). O trabalho é dividido em duas grandes partes: (1) Caracterização funcional de DZIP1 em células HeLa e (2) Caracterização de DZIP1 em CTA. Na primeira parte, a localização celular de DZIP1 foi determinada e é predominantemente citoplasmática com um padrão granular. A fim de identificar o tipo desses grânulos, ensaios de co-localização de DZIP1 com DCP1 (p-bodies) foram realizados e resultaram em não co-localização. Ensaio de imunofluorescência em células sob estresse oxidativo mostrou a co-localização de DZIP1 e TIA1 (marcador de grânulos de estresse). Estes resultados sugeriram que DZIP1 é um componente de complexos ribonucleoprotéicos (pelo menos em condições de estresse). Com o objetivo de identificar os mRNAs associados com DZIP1 foram realizadas imunoprecipitações dessa proteína e os mRNAs identificados por hibridação de microarranjos de DNA. As redes gênicas formadas pelos mRNAs alvos de DZIP1 indicam funções envolvendo o controle do ciclo celular e expressão gênica. O silenciamento de DZIP1 resultou em aumento no número de células em ensaio de curva de crescimento. Ensaios de EMSA utilizando sondas de homoribopolímeros sugerem que DZIP1 não interage diretamente com o RNA. A proteína DZIP1 está envolvida na via de sinalização Hh e um bloqueador específico dessa via é a ciclopamina. Observamos que a localização de DZIP1 sofre mudanças após a inibição da via Hh. Ainda, a expressão dos mRNAs associados a DZIP1 foi avaliada por qRT-PCR em células tratadas com ciclopamina e observou-se que a expressão deles aumenta com o tratamento. Porém, quando DZIP1 é silenciado ou superexpresso em células HeLa, o nível de expressão dos mRNAs associados não é afetado de forma significativa. Ainda assim, ensaios de decaimento de RNA com ActD foram realizados e demonstraram que DZIP1 não afeta a vida média dos mRNAs avaliados. Para estudar a associação de DZIP1 aos polissomos, extratos citoplasmáticos foram separados em gradiente de sacarose e a presença de DZIP1 nas frações polissomais foi visualizada por western blot. Na segunda parte deste trabalho, a localização de DZIP1 foi avaliada nas CTA em diferentes condições: normal, sob estresse oxidativo, com a via Hh bloqueada e ativada. DZIP1 apresentou um padrão de expressão granular e principalmente citoplasmático como observado em células HeLa. De maneira geral, os diferentes tratamentos não afetaram a localização de DZIP1. Em conclusão, a proteína DZIP1 participa de um complexo ribonucleoprotéico que transita nos compartimentos núcleo e citoplasma, está associada à maquinaria da tradução e sob estresse oxidativo está presente em grânulos de estresse. Estes resultados sugerem que a função de DZIP1 estaria associada ao transporte de mRNAs entre diferentes compartimentos funcionais, participando do ciclo de vida do mRNA na célula.