Caracterização dos genes que codificam a enzima dihidrolipomida desidrogenase (TcLip DH) e a proteína transportadora de hexoses (TcrHT1) em cepas do Trypanosoma Cruzi sensíveis e resistentes ao benzonidazol
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Data de Publicação: | 2008 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) |
Texto Completo: | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/35894 |
Resumo: | A glicose e outras hexoses são importantes para o funcionamento das células eucariotas. Os transportadores de hexoses são proteínas transmembrana que levam o substrato para dentro da célula. Na glicólise, o açúcar captado é convertido em piruvato e este, por sua vez, é convertido a acetil-CoA para o ciclo do ácido cítrico. A conversão do piruvato a acetil-CoA conta com a participação da enzima lipoamida desidrogenase (LipDH), uma flavoenzima homodimérica da família das FADdissulfeto oxiredutase que é também importante para o mecanismo de oxiredução da célula. Murta et al. (2008, in press), utilizando a metodologia Differential Display (DD) selecionaram os genes que codificam o transportador de hexoses (TcrHT1) e a enzima lipoamida desidrogenase (TcLipDH) como genes mais expressos em uma cepa do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao benzonidazol BZ e, que, portanto, seriam alvos em potencial para quimioterapia. Neste estudo, a fim de caracterizar os genes TcrHT1 e TcLipDH, foram analisados os níveis de mRNA; a organização genômica, a amplificação e a presença de polimorfismos; o nível de expressão ou atividade da proteína e a localização cromossômica em cepas do T. cruzi sensíveis e resistentes ao BZ. Ensaios de Northern blot e PCR em Tempo Real confirmaram os resultados de DD e mostraram que ambos estão cerca de 2X mais expressos na cepa com resistência induzida in vitro ao BZ, 17LER, quando comparada a seu par sensível, 17WTS. Por Southern blot confirmamos que o gene TcLipDH possui duas cópias e o TcrHT1, um arranjo em “tandem” e não estão amplificados no genoma de nenhuma cepa resistente. Além disso, foi encontrado um polimorfismo para o gene TcrHT1 que não está relacionado ao fenótipo de resistência a drogas e sim com o zimodema ao qual as cepas analisadas pertencem. Os resultados de Western blot mostraram que a enzima TcLipDH está igualmente expressa em todas as cepas analisadas à exceção da cepa 17LER na qual a proteína está 2X menos expressa em comparação à 17WTS. Devido à dificuldade de obter anticorpos anti-TcrHT1, os ensaios de Western blotting foram substituídos pelo ensaio de atividade enzimática no qual constatamos que a eficiência de captação de glicose é 40% menor na cepa 17LER quando comparada à 17WTS. A localização cromossômica desses genes não está relacionada à resistência e é zimodema dependente para o gene TcrHT1. Análises de bioinformática permitiram contextualizar evolutivamente ambos os genes e geraram informações interessantes sobre filogenia e anotação no genoma. |
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Santos, Paula FernandesRomanha, Álvaro JoséOliveira, OliveiraRuiz, Jerônimo ConceiçãoCarvalho, Andréa Teixeira deBartholomeu, Daniella CastanheiraMurta, Silvane Maria Fonseca2019-09-25T18:58:26Z2019-09-25T18:58:26Z2008SANTOS, Paula Fernandes. Caracterização dos genes que codificam a enzima dihidrolipomida desidrogenase (TcLip DH) e a proteína transportadora de hexoses (TcrHT1) em cepas do Trypanosoma Cruzi sensíveis e resistentes ao benzonidazol. 2008. 114 f. Dissertação (Mestrado em Biologia Parasitária) - Centro de Pesquisas René Rachou, Fundação Oswaldo Cruz, Belo Horizonte, 2008.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/35894A glicose e outras hexoses são importantes para o funcionamento das células eucariotas. Os transportadores de hexoses são proteínas transmembrana que levam o substrato para dentro da célula. Na glicólise, o açúcar captado é convertido em piruvato e este, por sua vez, é convertido a acetil-CoA para o ciclo do ácido cítrico. A conversão do piruvato a acetil-CoA conta com a participação da enzima lipoamida desidrogenase (LipDH), uma flavoenzima homodimérica da família das FADdissulfeto oxiredutase que é também importante para o mecanismo de oxiredução da célula. Murta et al. (2008, in press), utilizando a metodologia Differential Display (DD) selecionaram os genes que codificam o transportador de hexoses (TcrHT1) e a enzima lipoamida desidrogenase (TcLipDH) como genes mais expressos em uma cepa do T. cruzi com resistência induzida in vitro ao benzonidazol BZ e, que, portanto, seriam alvos em potencial para quimioterapia. Neste estudo, a fim de caracterizar os genes TcrHT1 e TcLipDH, foram analisados os níveis de mRNA; a organização genômica, a amplificação e a presença de polimorfismos; o nível de expressão ou atividade da proteína e a localização cromossômica em cepas do T. cruzi sensíveis e resistentes ao BZ. Ensaios de Northern blot e PCR em Tempo Real confirmaram os resultados de DD e mostraram que ambos estão cerca de 2X mais expressos na cepa com resistência induzida in vitro ao BZ, 17LER, quando comparada a seu par sensível, 17WTS. Por Southern blot confirmamos que o gene TcLipDH possui duas cópias e o TcrHT1, um arranjo em “tandem” e não estão amplificados no genoma de nenhuma cepa resistente. Além disso, foi encontrado um polimorfismo para o gene TcrHT1 que não está relacionado ao fenótipo de resistência a drogas e sim com o zimodema ao qual as cepas analisadas pertencem. Os resultados de Western blot mostraram que a enzima TcLipDH está igualmente expressa em todas as cepas analisadas à exceção da cepa 17LER na qual a proteína está 2X menos expressa em comparação à 17WTS. Devido à dificuldade de obter anticorpos anti-TcrHT1, os ensaios de Western blotting foram substituídos pelo ensaio de atividade enzimática no qual constatamos que a eficiência de captação de glicose é 40% menor na cepa 17LER quando comparada à 17WTS. A localização cromossômica desses genes não está relacionada à resistência e é zimodema dependente para o gene TcrHT1. Análises de bioinformática permitiram contextualizar evolutivamente ambos os genes e geraram informações interessantes sobre filogenia e anotação no genoma.Glucose and other hexoses are important for eukaryote cell function. The hexose transporters are transmembrane proteins that take the sugar substrate into the cell. This sugar undergoes glycolysis and is converted into pyruvate which generates Acetil-CoA for the citric acid cycle. This convertion of pyruvate to Acetil-CoA takes into account the participation of lipoamide dehydrogenase enzyme (LipDH), a homodimeric flavoenzyme from the FADdissulfide oxidorreductase family that is also important for the redox balance inside the cell. Murta et al. (2008 in press), using the Differential Display methodology, selected the genes encoding the Trypanosoma cruzi hexose transporter (TcrHT1) and the lipoamide dehydrogenase (TcLipDH) as genes with higher expression in a T. cruzi population (17LER) with in vitro induced resistance to benznidazole (BZ) than in its susceptible pair (17WTS). These genes could be, therefore, potential new targets for chemotherapy. In the present study we used T. cruzi strains susceptible and resistant to BZ to characterize TcrHT1 and TcLipDH genes in their mRNA levels, genomic organization and polymorphisms, protein expression or activity and, finally, their chromosomal location. We have also done an in silico characterization using different public databases. Northern blot and Real Time RT-PCR analysis confirmed the results obtained by DD. Both genes are in average 2-fold more expressed in the resistant population 17LER compared to 17WTS. Southern blot analysis confirmed that TcLipDH gene presents 2 copies while TcrHT1 presents a tandem array. These genes are not amplified in the genome of resistant T. cruzi samples. In addition, we detected a polymorphism for the TcrHT1 gene that is related to the zimodeme of T. cruzi instead of the resistance phenotype. Western blot analysis showed that LipDH enzyme is equally expressed in all strains analyzed, except in 17LER population that presented 2-fold less expression. Due to the difficulty in obtaining anti-TcrHT1 antibodies, sugar uptake assays were used instead of Western blot and showed that the TcrHT1 protein has a 40% lower efficiency in 17LER strain when compared to its susceptible counterpart. Bioinformatic tools allowed us to analyze both genes in the evolutionary context reinforcing the idea of TcrHT1 and TcLipDH as potential drug targets. We have also generated interesting information about phylogeny and genome annotation of TcLipDH and TcrHT1 genes.Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Rene Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.porDoença de ChagasTrypanosoma cruziDiidrolipoamida DesidrogenaseHexosesGenéticaSíntese químicaDoença de ChagasTrypanosoma cruziDiidrolipoamida DesidrogenaseHexosesCaracterização dos genes que codificam a enzima dihidrolipomida desidrogenase (TcLip DH) e a proteína transportadora de hexoses (TcrHT1) em cepas do Trypanosoma Cruzi sensíveis e resistentes ao benzonidazolCharacterization of genes encoding the enzyme dihidrolipomida dehydrogenase (TcLip DH) and hexose transporter protein (TcrHT1) of Trypanosoma cruzi in strains sensitive and resistant to benznidazoleinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisFundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Rene Rachou.Universidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, MG, BrasilMestrado AcadêmicoBelo Horizonte, MGFundação Oswaldo Cruz .Centro de Pesquisa René Rachou. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúdeinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZLICENSElicense.txttext/plain1748https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/35894/1/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD51ORIGINALpaula_fernandes.pdfapplication/pdf3888522https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/35894/2/paula_fernandes.pdffeadbf42ada531d0802b12f888d62c46MD52TEXTpaula_fernandes.pdf.txtpaula_fernandes.pdf.txtExtracted texttext/plain208600https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/35894/3/paula_fernandes.pdf.txt6d63133d39abebaf9abc254f32d7eca5MD53icict/358942022-01-06 10:45:50.8oai:www.arca.fiocruz.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352022-01-06T13:45:50Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false |
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