Uso de método de biologia molecular quantitativo (PCR real-time) na avaliação da carga parasitária em cães naturalmente infectados por Leishmania sp.

• Autor(a) principal: Nascimento, Cristiane Santos
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/4152
• topic: Leishmaniose Visceral; PCR real-time; Epidemiologia

INTRODUÇÃO: A leishmaniose visceral humana (LVH) é uma importante causa de morbidade e mortalidade no Brasil. Apesar dos avanços no conhecimento da epidemiologia da LVH, ainda existem lacunas importantes nas informações sobre os principais reservatórios desta zoonose. A técnica validada para avaliação da infectividade de reservatórios, xenodiagnóstico, é um método laborioso, demorado e difícil de executar, portanto, inapropriado para a triagem de grande número de animais. A padronização de método capaz de quantificar a carga parasitária presente em diferentes tecidos pode oferecer respostas importantes sobre a epidemiologia e a prevenção da LVH. OBJETIVO: Avaliar a carga parasitária em diferentes amostras biológicas de cães naturalmente infectados por Leishmania chagasi, utilizando método de biologia molecular quantitativo, PCR real-time (qPCR). MÉTODOS:Entre nov/2004 e abr/2007, foram realizados seis inquéritos soro-epidemiológicos em duas áreas endêmicas para LVH. Os cães soropositivos foram eutanasiados e submetidos a: exame de cultura, parasitológico direto e exame histológico para confirmação da infecção. Amostras de sangue periférico e fragmento de pele foram coletadas em todos os animais para determinação da carga parasitária. Adicionalmente, coletou-se também swab da conjuntiva, aspirado de medula óssea e linfonodo para realização do teste de qPCR nos cães incluídos no último inquérito (abr/2007). A técnica de qPCR foi padronizada utilizando um par de primers LEIF e LEIR e sonda LEIP selecionados no gene SSu rRNA. A seleção dos primers e sonda foi realizada utilizando o programa Primer Express (Perkin-Elmer-Applied Biosystems). A sonda fluorogênica foi sintetizada utilizando uma molécula FAM ligada na extremidade 5‟ e TAMRA ligada à extremidade 3‟(Perkin-Elmer -Applied Biosystems). Para determinar a carga parasitária foi realizada curva padrão com o DNA obtido da cultura de L. chagasi em concentrações variando de 101 a 107 parasitas/ml. Cada ponto da curva foi testado em triplicata. RESULTADOS: Dos 98 cães soropositivos identificados, foi detectado DNA de Leishmania em 57% das amostras de sangue total, em 56% das amostras de pele e em 100% das amostras de medula óssea, linfonodos e swab da conjuntiva. A carga parasitária em sangue periférico e swab da conjuntiva não ultrapassou 103 parasitas/ml sendo mais comumente detectado 1 a 10 parasitas/ml. Por outro lado, em pele, medula óssea e linfonodos a carga parasitária passou de 104 parasitas/ml, além disso, as quantidades de DNA detectadas se distribuíram com maior freqüência na categoria acima de 104 parasitas/ml, notadamente em amostras de linfonodos. CONCLUSÕES: O qPCR apresentou alta sensibilidade nas amostras biológicas estudadas, particularmente em linfonodos , medula óssea e pele. Nossos resultados indicam que o qPCR pode ser utilizado numa variedade de amostras biológicas para a quantificação da carga parasitária de cães naturalmente infectados por Leishmania sp. Estudos de validação do qPCR para avaliar a capacidade de reservatórios da LV, em lugar do xenodiagnóstico, e para investigar o papel do qPCR na triagem de cães em programas de controle/prevenção da LV devem ser conduzidos.