Caracterização molecular de proteínas hipotéticas diferencialmente expressas em Tripamastigota Metacíclico

• Autor(a) principal: Ramos, Bruno Dias
• Data de Publicação: 2014
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/8948
• topic: Doença de Chagas; Trypanosoma cruzi; Caracterização Molecular; Proteínas Hipotéticas; Tripomastigota Metacíclico; Chagas Disease; Trypanosoma cruzi; Molecular characterization; Hypothetical Proteins; Metacyclic Trypomastigotes

Desde sua descoberta, no inicio do século 20, o protozoário parasita causador da Doença de Chagas, Trypanosoma cruzi, se tornou alvo de estudo em diversas instituições de pesquisa ao redor do mundo. Portador de características peculiares interessantes, T. cruzi é um excelente modelo de estudo de processo de regulação pós-transcricional. O parasita teve o seu genoma sequênciado em 2005, e foi observado que muitos dos genes contidas em seu genoma não apresentaram uma descrição funcional confiável, sendo anotados como codificadores de "proteínas hipotéticas". Tendo em vista essa ausência de caracterização funcional de uma parcela considerável do genoma de T. cruzi, o presente trabalho se propôs a realizar a caracterização molecular de um grupo de 10 proteínas de T. cruzi anotadas como "hipotéticas", e que se apresentavam diferencialmente expressas na forma celular tripomastigota metacíclica do parasita, a forma infectiva não-replicativa que inicialmente infecta o hospedeiro mamífero na via usual de transmissão da doença via o inseto vetor. Após amplificação, todos os dez genes selecionados no estudo foram clonados em vetor de entrada (pDONRTM221, Invitrogen), a partir do qual foi possível a transferência do fragmento gênico para outros vetores, visando diferentes abordagens de análise. Todos os genes foram transferidos com sucesso para o vetor de expressão pDESTTM17, de expressão em Escherichia coli, e nove para o vetor pTcGFP, de expressão no próprio T. cruzi e que fusiona à proteína uma etiqueta fluorescente. Dos genes inseridos no pDESTTM17, sete deles foram com sucesso expressos em E. coli, sendo obtidos anticorpos policlonais contra seis das proteínas expressas. Os ensaios de western blot realizados com os soros obtidos contra extratos das quatro formas celulares de T. cruzi corroboram os dados previamente obtidos de sequenciamento de mRNA. Foram realizados ensaios de imunolocalização com os soros obtidos, no entanto, os padrões encontrados nas imunolocalizações foram diferentes dos observados pelas proteínas fusionadas à etiqueta fluorescente GFP. Ensaios de nocaute gênico das proteínas estudadas foram iniciados, e em breve virão a contribuir para o trabalho. Espera-se que os dados obtidos com esse estudo venham melhorar a anotação funcional e a compreensão das proteínas selecionadas.