Análise do papel do inflamassoma na imunopatogênese do Eritema Nodoso Hanseniano
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Data de Publicação: | 2021 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) |
Texto Completo: | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/53308 |
Resumo: | A hanseníase, causada pelo Mycobacterium leprae, pode ter seu curso crônico interrompido em 30-50% dos pacientes multibacilares por episódios agudos de uma reação inflamatória sistêmica denominada eritema nodoso hanseniano (ENH), que acelera o dano nos nervos periféricos e aumenta as incapacidades físicas. Embora a presença de um infiltrado inflamatório rico em neutrófilos seja uma das característica das novas lesões cutâneas que surgem no ENH, os exatos mecanismos que disparam a reação ainda são desconhecidos. Algumas evidências apontam a importância da imunidade inata durante o ENH, como a observação de maior expressão de TLR-9, receptor de reconhecimento de DNA, em biopsias de pele e leucócitos sanguíneos de pacientes com ENH, bem como a detecção de níveis elevados no soro das citocinas pró-inflamatórias TNF e IL-1β. A citocina IL-1β é produzida pelo inflamassoma, que é ativado por receptores citosólicos, como o NLRP3, culminando na ativação de caspase-1 e clivagem da pró-IL-1β. Acredita-se que a massiva morte de bacilos em resposta à poliquimioterapia (PQT), com a subsequente liberação de componentes bacterianos, seja um evento importante na ativação da resposta inflamatória observada no ENH. Dessa forma, o trabalho buscou investigar a participação de vias da imunidade inata na patogênese do ENH, por meio do estudo da participação do inflamassoma. Nosso estudo buscou identificar assinaturas genéticas discriminatórias de ENH em células sanguíneas de pacientes e também investigou o transcriptoma após 7 dias do início da administração de talidomida, a droga de escolha utilizada para o tratamento do ENH no Brasil. A análise dos dados obtidos pelo RNAseq demonstrou um transcriptoma mais pró-inflamatório durante o episódio reacional quando comparado aos pacientes multibacilares não reacionais, com maior expressão de genes relacionados à imunidade inata, com destaque para vias associadas à ativação e degranulação neutrofílica. Já o perfil transcricional observado após 7 dias de início de tratamento com talidomida manteve a característica de enriquecimento das vias de ativação e degranulação neutrofílica, embora, em sua maioria, novos genes pertencentes a estas vias foram detectados, acrescida de uma assinatura transcricional de genes associados a vias de resposta imune humoral. As análises de RNAseq apontaram a via do inflamassoma como enriquecida nos pacientes ENH e análises por qRT-PCR confirmaram essa observação, visto que há uma maior expressão de pró-IL1β; pró-caspase 1; pró-caspase 4; AIM2 e NLRC4 em células sanguíneas dos pacientes ENH quando comparado aos pacientes multibacilares não reacionais, sugerindo, com isso, a ativação do inflamassoma sistemicamente. Também pudemos observar a ativação do inflamassoma nas lesões cutâneas do ENH ao detectar clivagem de IL-1β, bem como co-localização de NLRP3 e caspase-1 nestas lesões. O tratamento com talidomida diminuiu os níveis de IL-1β e caspase-1 maduras nas lesões ENH. Também observamos que o soro de pacientes reacionais induz uma maior produção de IL-1β por leucócitos sanguíneas de indivíduos sadios em um processo dependente de TLR-9, quando comparado a soro de pacientes multibacilares não reacionais. Estendendo nossas análises, DNA de M. leprae foi detectado em lesões de pele de pacientes que desenvolveram ENH mais de dois anos após o termino da PQT, que por sua vez também apresentaram sinais de ativação do inflamassoma. Finalmente, verificamos que componentes do envoltório celular do M. leprae, como os glicolipídios PIMs e PGL-I, são capazes de ativar in vitro o inflamassoma em combinação com estímulos de primeiro ou segundo sinal. Dessa forma, nossos resultados sugerem uma importância das vias de ativação e resposta neutrofílica na resposta sistêmica durante o episódio reacional, bem como sugerem a participação do inflamassoma no ENH tanto localmente, nas lesões cutâneas, como sistemicamente, em leucócitos periféricos, em um processo que envolve o reconhecimento de DNA de M. leprae, via de TLR-9, além do reconhecimento de outros componentes bacterianos. No grupo de pacientes tratados com talidomida também se observou diminuição da ativação do inflamassoma, o que poderia estar associado à sua eficácia no tratamento do ENH. Com isso, nossos dados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos de imunopatogênese do ENH, apontando possíveis novos alvos para sua intervenção terapêutica |
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Rosa, Thabatta Leal Silveira AndrezoPinheiro, Roberta OlmoViola, Patrícia Torres BozzaZamboni, Dario SimõesRodrigues, Luciana SilvaPereira, Verônica SchmitzPessolani, Maria Cristina Vidal2022-06-16T01:23:19Z2022-06-16T01:23:19Z2021ROSA, Thabatta Leal Silveira Andrezo. Análise do papel do inflamassoma na imunopatogênese do Eritema Nodoso Hanseniano. 2021. 298 f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) - Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2021.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/53308A hanseníase, causada pelo Mycobacterium leprae, pode ter seu curso crônico interrompido em 30-50% dos pacientes multibacilares por episódios agudos de uma reação inflamatória sistêmica denominada eritema nodoso hanseniano (ENH), que acelera o dano nos nervos periféricos e aumenta as incapacidades físicas. Embora a presença de um infiltrado inflamatório rico em neutrófilos seja uma das característica das novas lesões cutâneas que surgem no ENH, os exatos mecanismos que disparam a reação ainda são desconhecidos. Algumas evidências apontam a importância da imunidade inata durante o ENH, como a observação de maior expressão de TLR-9, receptor de reconhecimento de DNA, em biopsias de pele e leucócitos sanguíneos de pacientes com ENH, bem como a detecção de níveis elevados no soro das citocinas pró-inflamatórias TNF e IL-1β. A citocina IL-1β é produzida pelo inflamassoma, que é ativado por receptores citosólicos, como o NLRP3, culminando na ativação de caspase-1 e clivagem da pró-IL-1β. Acredita-se que a massiva morte de bacilos em resposta à poliquimioterapia (PQT), com a subsequente liberação de componentes bacterianos, seja um evento importante na ativação da resposta inflamatória observada no ENH. 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O tratamento com talidomida diminuiu os níveis de IL-1β e caspase-1 maduras nas lesões ENH. Também observamos que o soro de pacientes reacionais induz uma maior produção de IL-1β por leucócitos sanguíneas de indivíduos sadios em um processo dependente de TLR-9, quando comparado a soro de pacientes multibacilares não reacionais. Estendendo nossas análises, DNA de M. leprae foi detectado em lesões de pele de pacientes que desenvolveram ENH mais de dois anos após o termino da PQT, que por sua vez também apresentaram sinais de ativação do inflamassoma. Finalmente, verificamos que componentes do envoltório celular do M. leprae, como os glicolipídios PIMs e PGL-I, são capazes de ativar in vitro o inflamassoma em combinação com estímulos de primeiro ou segundo sinal. 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Com isso, nossos dados contribuem para uma melhor compreensão dos mecanismos de imunopatogênese do ENH, apontando possíveis novos alvos para sua intervenção terapêuticaLeprosy, caused by Mycobacterium leprae, may have its chronic course interrupted in 30-50% of multibacillary patients by acute systemic inflammatory episodes known as Erythema Nodosum Leprosum (ENL), which accelerates peripheral nerve damage and increases physical disabilities. Although a neutrophilic inflammatory infiltrate is a hallmark of the new skin lesions that appear during ENL, the exact mechanisms that trigger the reaction are still unknown. Some evidences point to an importance of the innate immunity during ENL, such as the observation of increased expression of TLR-9, which recognizes DNA, in skin biopsies and leukocytes from ENL patients, as well as, the detection of increased levels on ENL patients sera of the pro-inflammatory cytokines TNF and IL-1β. IL-1β cytokine is produced by the inflammasome, which is activated by cytosolic receptors, such as NLRP3, culminating in caspase-1 activation and pro-IL-1β cleavage. It is believed that massive bacilli death due to response to multidrug therapy (MDT) treatment with subsequent release of bacterial components may be an important event responsible for activating the inflammatory response in ENH. Thus, this work investigate the participation of innate immunity pathways in ENL pathogenesis, through the study of the inflammasome involvement. The idea was to identify discriminatory gene signatures in blood cells from ENL patients and also to investigate the transcriptome after 7 days from the start of thalidomide administration, the drug of choice for ENL treatment in Brazil. Analysis of RNAseq data demonstrated a more pro-inflammatory transcriptome during the reactional episode when compared to non-reactional LL patients, with increased expression of genes related to innate immunity, mainly of pathways associated to neutrophils activation and degranulation. The transcriptomic profile observed 7 days after the start of thalidomide treatment maintained the characteristic of enriched neutrophil activation and degranulation pathways, although, mostly, new genes were detected for these pathways, together with a transcriptional signature of genes related to humoral immune response. RNAseq analysis also indicated that inflammasome pathway is enriched in ENL patients and qRT-PCR analysis confirmed this observation, since there is an increased expression of pro-IL1β; pro-caspase 1; pro-caspase 4; AIM2 and NLRC4 in blood cells from ENL patients in comparison to multibacillary non reactional patients, suggesting that the inflammasome is active systemically. We also observed inflammasome activation in the skin lesions by detecting IL-1β cleavage, as well as co-localization of NLRP3 and caspase-1 in ENL in these lesions. Thalidomide treatment decreased the levels of mature IL-1β and caspase-1 in ENL skin lesions. We also showed that sera from ENL patients induce an increased production of IL-1β by blood leukocytes from healthy donors in a process dependent of TLR-9 when compared to sera from non-reactional multibacillary patients. Expanding our analysis, M. leprae DNA was detected in skin lesions of patients that developed ENL more than two years after conclusion of MDT, which, in turn, also displayed signs of inflammasome activation. Lastly, we verified that ML cell wall components, such as the glycolipids PIMs and PGL-I, are able to activate the inflammasome in vitro in combination with first or second signals stimuli. Thus, our results suggest the importance of neutrophil activation and response pathways in the systemic response during ENL, as well as they suggest the involvement of the inflammasome in ENL both locally, in skin lesions, and systemically, in peripheral leukocytes, in a process that may involve the recognition of M. leprae DNA, though TLR-9, together with the recognition of other mycobacterial components. In the group of thalidomide treated patients it was also observed the decrease of inflammasome activation, which might be associated to its effectiveness in ENL treatment. Therefore, our data contribute to a better understand the mechanisms underlying ENL immunopathogenesis, revealing possible new targets for its therapeutic interventionFundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.porInflamassomaEritema Nodoso HansenianoTalidomidaHanseníaseRNAseqInflamassomosEritema NodosoTalidomidaHanseníaseReplicação de Sequência AutossustentávelAnálise do papel do inflamassoma na imunopatogênese do Eritema Nodoso Hansenianoinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis2021Instituto Oswaldo CruzFundação Oswaldo CruzRio de JaneiroPrograma de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecularinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZLICENSElicense.txttext/plain1748https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/53308/1/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD51ORIGINAL000250178.pdfapplication/pdf9001433https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/53308/2/000250178.pdf644eb44a697727efdf56c7c66fb6db50MD52icict/533082022-06-15 22:23:19.432oai:www.arca.fiocruz.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352022-06-16T01:23:19Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false |
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