Avaliação de métodos espectrofotométricos para a determinação do teor de proteínas residuais nas preparações vacinais de Poliribosil Ribitol Fosfato (PRP)
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Data de Publicação: | 2016 |
Tipo de documento: | Dissertação |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) |
Texto Completo: | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/35573 |
Resumo: | Pneumonia grave e meningite são doenças provocadas pela bactéria Haemophilus influenzae tipo b (Hib) que podem ser previnidas por vacinas feitas a partir do polissacarídeo capsular de Hib (poliribosil ribitol fosfato; 5-D-ribitol-(1 1)--D-ribose-3-fosfato; PRP). Na purificação do PRP, os principais contaminantes (ácidos nucleicos, proteínas e endotoxinas) são removidos seletivamente obtendo-se um produto de alta imunogenicidade. O clássico método de Lowry tem sido utilizado para quantificação de proteínas no PRP, porém tem demonstrado ser inadequado para o baixíssimo nível de impurezas encontrado. Este trabalho buscou um método mais sensível e foi aplicado a três lotes experimentais de PRP de BioManguinhos/Fiocruz, comparando-se ao método de Lowry, métodos espectrofotométricos Peterson e Smith no intervalo de 2,5 a 15 µg mL-1. Os resultados obtidos indicaram a superioridade do método de Peterson, com sensibilidade de 0,0096 µg.mL-1, precisão com CV% de 5,0 a 6,9%, acurácia de 97%, limites de detecção de 0,1 µg.mL-1 e limite de quantificação de 0,5 µg.mL-1. Pelo método Lowry foi obtida sensibilidade de 0,0039 µg.mL-1 e o CV% na quantificação foi 3,8% enquanto com o método de Smith obteve-se CV% de 18 a 48% e sensibilidade de 0,0026 µg.mL-1 , não obstante, devido à necessidade de incubação a 60ºC, este último demonstrou ser inadequado para quantificação das amostras de PRP que não são estáveis a esta temperatura. Além das vantagens citadas, o método de Peterson contribuiu na redução de resíduos químicos e na redução do tempo de análise. |
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Lemos, Izabel Azevedo deJacob, Silvana do CoutoCardoso, Monica Ferreira Moreira CarvalhoNascimento, Hilton JorgeSpisso, Bernardete FerrazSilva Junior, José Godinho daSpisso, Bernardete FerrazSilva Junior, José Godinho da2019-09-12T20:14:44Z2019-09-12T20:14:44Z2016LEMOS, Izabel Azevedo. Avaliação de métodos espectrofotométricos para a determinação do teor de proteínas residuais nas preparações vacinais de Poliribosil Ribitol Fosfato (PRP). 2016. 112 f. Dissertação (Mestrado em Vigilância Sanitária) – Instituto Nacional em Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2016.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/35573Pneumonia grave e meningite são doenças provocadas pela bactéria Haemophilus influenzae tipo b (Hib) que podem ser previnidas por vacinas feitas a partir do polissacarídeo capsular de Hib (poliribosil ribitol fosfato; 5-D-ribitol-(1 1)--D-ribose-3-fosfato; PRP). Na purificação do PRP, os principais contaminantes (ácidos nucleicos, proteínas e endotoxinas) são removidos seletivamente obtendo-se um produto de alta imunogenicidade. O clássico método de Lowry tem sido utilizado para quantificação de proteínas no PRP, porém tem demonstrado ser inadequado para o baixíssimo nível de impurezas encontrado. Este trabalho buscou um método mais sensível e foi aplicado a três lotes experimentais de PRP de BioManguinhos/Fiocruz, comparando-se ao método de Lowry, métodos espectrofotométricos Peterson e Smith no intervalo de 2,5 a 15 µg mL-1. Os resultados obtidos indicaram a superioridade do método de Peterson, com sensibilidade de 0,0096 µg.mL-1, precisão com CV% de 5,0 a 6,9%, acurácia de 97%, limites de detecção de 0,1 µg.mL-1 e limite de quantificação de 0,5 µg.mL-1. Pelo método Lowry foi obtida sensibilidade de 0,0039 µg.mL-1 e o CV% na quantificação foi 3,8% enquanto com o método de Smith obteve-se CV% de 18 a 48% e sensibilidade de 0,0026 µg.mL-1 , não obstante, devido à necessidade de incubação a 60ºC, este último demonstrou ser inadequado para quantificação das amostras de PRP que não são estáveis a esta temperatura. Além das vantagens citadas, o método de Peterson contribuiu na redução de resíduos químicos e na redução do tempo de análise.Severe pneumonia and meningitis are diseases caused by the bacterium Haemophilus influenzae type b (Hib) that can be prevented by vaccines made from the capsular polysaccharide of Hib (polyribosyl ribitol phosphate; 5-D-ribitol-(1 1)--D-ribose-3-phosphate; PRP). In the purification of PRP, the major contaminants (nucleic acids, proteins and endotoxins) are selectively removed obtaining a product of high immunogenicity. The classic Lowry method has been used to quantify the protein in PRP, but has been shown to be inadequate for the very low level of impurities found. This work sought a more sensitive method and was applied to three experimental lots of PRP produced at BioManguinhos/Fiocruz. Comparing to the Lowry method, the spectrophotometric methods Peterson and Smith in the range of 2.5 to 15 μg mL-1, the results indicated the superiority of the Peterson method, with sensitivity of 0.0096 μg.mL-1, precision with CV% of 5.0 to 6.9%, accuracy of 97%, detection limits of 0.1 μg.mL-1 and the quantification limit of 0.5 μg.mL-1. By the Lowry method, was obtained sensitivity of 0.0039 μg.mL-1 and the CV% in the quantification was of 22.5 to 33.8%, whereas by the Smith method was obtained CV% of 18 to 48% and sensitivity of 0.0026 μg.mL-1, nevertheless due to the need for incubation at 60 °C it was found to be inadequate for protein quantification of the PRP samples that are not stable at this temperature. The Peterson method also provided underlying benefits in increased solubility and reduced analysis time.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.porPolissacarídeo de Haemophilus Influenzae tipo bVacina HibQuantificação de proteínasMétodo EspectrofotométricoMétodo de PetersonMétodo de Folin-LowryMétodo de SmithPolysaccharide Haemophilus influenzae type bHib vaccineQuantification of proteinSpectrophotometric methodPeterson methodFolin-Lowry methodSmith methodAvaliação de métodos espectrofotométricos para a determinação do teor de proteínas residuais nas preparações vacinais de Poliribosil Ribitol Fosfato (PRP)info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis2016Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.Mestrado AcadêmicoRio de JaneiroPrograma de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária.info:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZLICENSElicense.txttext/plain1748https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/35573/1/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD51ORIGINALizabel_azevedo_de_lemos.pdfapplication/pdf2136767https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/35573/2/izabel_azevedo_de_lemos.pdffe6f4d7e95ac9ec4aa8fde0c419c23b3MD52TEXTizabel_azevedo_de_lemos.pdf.txtizabel_azevedo_de_lemos.pdf.txtExtracted texttext/plain191038https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/35573/3/izabel_azevedo_de_lemos.pdf.txt25a7bdd7a60949f1af7e89aa66434178MD53icict/355732019-09-16 19:11:06.155oai:www.arca.fiocruz.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352019-09-16T22:11:06Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false |
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