Avaliação da associação entre expressão da proteína “Kinetoplastid Membrane Protein-11” (KMP-11) e virulência de Leishmania amazonensis

• Autor(a) principal: Santos, Elisangela Madureira dos
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/4246
• topic: Leishmania mexicana ; Infecção; Murinae ; Virulência; Kinetoplastida; Proteínas de Membrana; Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real; Análise de Sequência de RN; Análise de Variância

As leishmanioses formam um grupo de doenças que afetam 350 milhões de pessoas atualmente, atingindo 88 países em todo o mundo com uma estimativa de 1-2 milhões de novos casos por ano. O desfecho da infecção causada por Leishmania depende tanto de fatores do patógeno como do hospedeiro, embora a virulência de Leishmania possa ser modulada por fatores ambientais e genéticos relacionados aos hospedeiros mamíferos e vetores, os determinantes moleculares são elementos-chave no estabelecimento da infecção, ou seja, são os fatores que determinam a virulência. A KMP-11 é uma glicoproteína que está presente em todos os cinetoplastideos. O presente estudo avaliou a expressão do gene de KMP-11 de L. amazonensis ao nível de RNA e ao nível de proteína, durante passagens sucessivas de promastigotas de fase estacionária através de cultivo in vitro, investigando se há associação entre a sua expressão e a virulência dos parasitos. A avaliação da virulência dos parasitos mantidos em cultura foi realizada através do acompanhamento da evolução da infecção experimental murina (modelo in vivo) durante um período de dez semanas, juntamente com a observação do surgimento de ulceração. A quantificação da carga parasitária foi realizada nos linfonodos drenantes das lesões, através da através da técnica de diluição limitante A avaliação também foi realizada pela infecção de macrófagos murinos (modelo in vitro). Os resultados de medição de pata foram analisados pelo teste não paramétrico ANOVA 2 fatores, seguido do pós-teste de Bonferroni. Além disso, foi realizada a determinação da proporção de metacíclicas nos promastigotas de fase estacionária mantidos em cultura, através da técnica de lise pelo complemento. Nossos resultados mostraram que há um decréscimo da virulência dos promastigotas de fase estacionária ao longo do número de passagens, pois os camundongos infectados com as passagens iniciais desenvolveram lesões maiores do que aqueles com os promastigotas mantidos em cultura por mais tempo. Quanto ao surgimento de ulcerações, na 10a semana pós-infecção, todos os animais infectados com promastigotas de 1a passagem apresentavam lesões ulceradas, enquanto que nenhum dos camundongos infectados com promastigotas de 20a passagem apresentava lesão ulcerada. Na infecção in vitro, a carga parasitária nos macrófagos testados diminuiu em função do número das subculturas, o que foi demonstrado através do decréscimo da porcentagem média de macrófagos infectados e pela quantidade média de amastigotas a cada 100 macrófagos infectados. A quantificação da carga parasitária foi realizada nos linfonodos drenantes da lesão dos camundongos infectados, confirmando a diminuição da virulência dos promastigotas. A quantificação da proporção de promastigotas metacíclicas demonstrou que a porcentagem diminui ao longo do tempo de subcultivo. A avaliação da expressão de KMP-11 na superfície de promastigotas por citometria de fluxo demonstrou um decréscimo na expressão da proteína proporcional ao número de subculturas. Verificou-se, portanto, uma associação entre a expressão da proteína KMP-11 e a virulência de promastigotas de L. amazonensis. Os resultados dos ensaios de PCR em tempo real demonstraram que não há diferença estatisticamente significativa na quantidade de transcritos do gene da proteína KMP-11 entre as passagens analisadas. Entretanto, a perda da virulência associada com a diminuição da expressão da proteína KMP-11 indica que esta molécula possua uma função na infectividade dos promastigotas de Leishmania amazonensis, atuando possivelmente como um fator de virulência.