Caracterização de genes regulados pelas vias das MAP quinases e triagem de inibidores para o desenvolvimento de novos fármacos contra o Schistosoma mansoni
Autor(a) principal: | |
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Data de Publicação: | 2020 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) |
Texto Completo: | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/55276 |
Resumo: | Schistosoma mansoni utiliza sinais extracelulares específicos para gerar respostas celulares apropriadas para se desenvolver e sobreviver no corpo do seu hospedeiro. Nesse contexto, a transdução de sinal envolvendo proteínas quinases eucarióticas (ePKs) tem papéis essenciais em mecanismos reguladores. Recentemente, nosso grupo mostrou que as Proteínas Quinases Ativadas por Mitógenos (MAPKs), como SmERK1, SmERK2, Smp38 e SmJNK, estão envolvidas na reprodução/oviposição, sobrevivência e desenvolvimento do parasito, indicando que essas MAPKs podem ser alvos promissores para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da esquistossomose. Dados de RNASeq também demonstraram que as vias de Smp38 e SmJNK regulam a expressão de um grande conjunto de genes, dentre eles dois genes importantes para o ciclo de vida do parasito: (1) proteína de ligação ao RNAm do inibidor do ativador do plasminogênio 1 (SmPAI-RBP1), responsável pela estabilidade/regulação do PAI-1, que funciona como o principal inibidor do ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e da uroquinase (uPA) e, portanto, da fibrinólise; e (2) hipoxantina-guanina fosforibosiltransferases (SmHGPRTases), uma família de enzimas chave (codificada por cinco genes diferentes) para via de salvação de purinas, uma vez que o parasito não tem a capacidade de realizar a síntese de novo de purinas. Dessa forma, este trabalho procurou identificar compostos ativos e específicos para as MAPKs de S. mansoni e caracterizar SmPAI-RBP1 e SmHGPRTases, pois esses dois genes poderiam ser alvos de drogas mais específicos contra a esquistossomose. Primeiramente, para verificar a atividade das PKs e, posteriormente, realizar a triagem de moléculas usando inibidores das mesmas, as proteínas SmERK1, SmERK2 e SmJNK foram expressas para validar um ensaio de atividade protéica com base na investigação do sítio de ligação ao ATP usando a detecção de polarização da fluorescência através do uso de uma sonda denominada BODIPY® FL ATP-γ-S. Como alternativa a este teste, também realizamos uma triagem in silico para priorização de moléculas disponíveis na Managed Chemical Compound Collection (MCCC) por “docking” para predizer ligações das moléculas ao sítio de ligação ao ATP de cada PK do S. mansoni e dos ortólogos correspondentes em humanos para posterior teste in vitro. Além disso, os papéis funcionais de SmHGPRTases e SmPAI-RBP1 foram caracterizados usando RNA de interferência e quantificação da atividade de proteínas. Neste trabalho, conseguimos expressar todas as PKs e purificar SmJNK e SmERK1. Também desenvolvemos um ensaio baseado em polarização de fluorescência da luz para verificar a capacidade de ligação das PKs ao ATP e validamos a triagem como um método “high-throughput” usando moléculas preditas em se ligar ao sítio de ligação ao ATP da PKA. Além disso, a priorização de compostos usando o “docking” in silico provou ser uma ferramenta muito útil. De 80.000 moléculas do MCCC, 140 foram selecionadas, dentre essas, 61 foram ativas, sendo nove para SmERK1, uma para SmERK2, doze para Smp38, cinco para JNK e 36 para todas as PKs. Além disso, usando inibidores preditos para Smp38 e SmJNK, confirmamos experimentalmente que a via Smp38 regula SmHGPRTase 1, SmHGPRTase 3 e SmPAI-RBP1 e a via SmJNK regula SmPAI-RBP1. Nossos resultados também sugerem que a atividade de SmHGPRTases tem um papel essencial no desenvolvimento de esporocistos e esquistossômulos, uma vez que diferenças significativas na viabilidade, tamanho e/ou forma foram observadas após silenciamento in vitro. Além disso, o silenciamento de SmHGPRTases influenciou o desenvolvimento do ovário e a maturação dos ovos em fêmeas recuperadas de infecções em mamíferos, promovendo também alterações de movimento nos vermes silenciados in vitro. Além disso, o SmPAI-RBP1 pode estar envolvido no desenvolvimento de esporocistos e esquistossômulos, e também pode estar relacionado a danos no tegumento em machos nos quais a altura dos tubérculos foi reduzida. Concluindo, este estudo forneceu ferramentas úteis para descoberta de possíveis novos fármacos tendo como alvos PKs de S. mansoni e de outros organismos identificando um grande número de moléculas ativas para diferentes estágios de vida do S. mansoni e também contribuiu para elucidar os papéis funcionais de genes essenciais para o ciclo de vida do S. mansoni. |
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Batista, Izabella Cristina AndradeSilva, Carlos Eduardo CalzavaraMourão, Marina MoraesSilva, Carlos Eduardo CalzavaraKano, Flora SatikoSales Júnior, Policarpo AdemarFigueiredo, Bárbara de Castro PimentelAraújo, Ricardo NascimentoMourão, Marina Moraes2022-10-24T17:57:37Z2022-10-24T17:57:37Z2020BATISTA, Izabella Cristina Andrade. Caracterização de genes regulados pelas vias das MAP quinases e triagem de inibidores para o desenvolvimento de novos fármacos contra o Schistosoma mansoni. Belo Horizonte: s.n, 2020. 220 p. Tese(Doutorado em Ciências da Saúde. Área de Concentração: Biologia Celular e Molecular, Genética e Bioinformática)-Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/55276Schistosoma mansoni utiliza sinais extracelulares específicos para gerar respostas celulares apropriadas para se desenvolver e sobreviver no corpo do seu hospedeiro. Nesse contexto, a transdução de sinal envolvendo proteínas quinases eucarióticas (ePKs) tem papéis essenciais em mecanismos reguladores. Recentemente, nosso grupo mostrou que as Proteínas Quinases Ativadas por Mitógenos (MAPKs), como SmERK1, SmERK2, Smp38 e SmJNK, estão envolvidas na reprodução/oviposição, sobrevivência e desenvolvimento do parasito, indicando que essas MAPKs podem ser alvos promissores para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da esquistossomose. Dados de RNASeq também demonstraram que as vias de Smp38 e SmJNK regulam a expressão de um grande conjunto de genes, dentre eles dois genes importantes para o ciclo de vida do parasito: (1) proteína de ligação ao RNAm do inibidor do ativador do plasminogênio 1 (SmPAI-RBP1), responsável pela estabilidade/regulação do PAI-1, que funciona como o principal inibidor do ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e da uroquinase (uPA) e, portanto, da fibrinólise; e (2) hipoxantina-guanina fosforibosiltransferases (SmHGPRTases), uma família de enzimas chave (codificada por cinco genes diferentes) para via de salvação de purinas, uma vez que o parasito não tem a capacidade de realizar a síntese de novo de purinas. Dessa forma, este trabalho procurou identificar compostos ativos e específicos para as MAPKs de S. mansoni e caracterizar SmPAI-RBP1 e SmHGPRTases, pois esses dois genes poderiam ser alvos de drogas mais específicos contra a esquistossomose. Primeiramente, para verificar a atividade das PKs e, posteriormente, realizar a triagem de moléculas usando inibidores das mesmas, as proteínas SmERK1, SmERK2 e SmJNK foram expressas para validar um ensaio de atividade protéica com base na investigação do sítio de ligação ao ATP usando a detecção de polarização da fluorescência através do uso de uma sonda denominada BODIPY® FL ATP-γ-S. Como alternativa a este teste, também realizamos uma triagem in silico para priorização de moléculas disponíveis na Managed Chemical Compound Collection (MCCC) por “docking” para predizer ligações das moléculas ao sítio de ligação ao ATP de cada PK do S. mansoni e dos ortólogos correspondentes em humanos para posterior teste in vitro. Além disso, os papéis funcionais de SmHGPRTases e SmPAI-RBP1 foram caracterizados usando RNA de interferência e quantificação da atividade de proteínas. Neste trabalho, conseguimos expressar todas as PKs e purificar SmJNK e SmERK1. Também desenvolvemos um ensaio baseado em polarização de fluorescência da luz para verificar a capacidade de ligação das PKs ao ATP e validamos a triagem como um método “high-throughput” usando moléculas preditas em se ligar ao sítio de ligação ao ATP da PKA. Além disso, a priorização de compostos usando o “docking” in silico provou ser uma ferramenta muito útil. De 80.000 moléculas do MCCC, 140 foram selecionadas, dentre essas, 61 foram ativas, sendo nove para SmERK1, uma para SmERK2, doze para Smp38, cinco para JNK e 36 para todas as PKs. Além disso, usando inibidores preditos para Smp38 e SmJNK, confirmamos experimentalmente que a via Smp38 regula SmHGPRTase 1, SmHGPRTase 3 e SmPAI-RBP1 e a via SmJNK regula SmPAI-RBP1. Nossos resultados também sugerem que a atividade de SmHGPRTases tem um papel essencial no desenvolvimento de esporocistos e esquistossômulos, uma vez que diferenças significativas na viabilidade, tamanho e/ou forma foram observadas após silenciamento in vitro. Além disso, o silenciamento de SmHGPRTases influenciou o desenvolvimento do ovário e a maturação dos ovos em fêmeas recuperadas de infecções em mamíferos, promovendo também alterações de movimento nos vermes silenciados in vitro. Além disso, o SmPAI-RBP1 pode estar envolvido no desenvolvimento de esporocistos e esquistossômulos, e também pode estar relacionado a danos no tegumento em machos nos quais a altura dos tubérculos foi reduzida. Concluindo, este estudo forneceu ferramentas úteis para descoberta de possíveis novos fármacos tendo como alvos PKs de S. mansoni e de outros organismos identificando um grande número de moléculas ativas para diferentes estágios de vida do S. mansoni e também contribuiu para elucidar os papéis funcionais de genes essenciais para o ciclo de vida do S. mansoni.Schistosoma mansoni relies inspecific environmental extracellular signals to generate appropriate cellular responses to develop and survive. In this context, signal transduction involving eukaryotic protein kinases (ePKs) has essential roles in regulatory mechanisms. Recently, our group have demonstrated that Mitogen Activated Protein Kinases (MAPKs), such as SmERK1, SmERK2, Smp38 and SmJNK, are involved in parasite reproduction/oviposition, survival and development, indicating that these PKs may be of interest as targets for the development of new drugs to treat schistosomiasis. RNASeq data also demonstrated that Smp38 and SmJNK pathway regulate the expression of a large set of genes, among them, two important genes for the parasite life cycle: (1) plasminogen activator inhibitor 1 RNA-binding protein (SmPAI-RBP1), responsible for the stability/regulation of the PAI-1, that functions as the principal inhibitor of tissue plasminogen activator (tPA) and urokinase (uPA) and hence fibrinolysis; and (2) hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferases (SmHGPRTases), a key enzyme family (encoded by five different genes) in the purine-salvage pathway, since the parasite does not carry synthesis de novo of purine. This work sought to identify active and specific compounds to the MAPKs of S. mansoni and to characterize SmPAI-RBP1 and SmHGPRTases as those two genes could result as more specific drug targets against schistosomes. First, to verify ePKs activity and, posteriorly, perform compounds screening using PKs inhibitors, we aimed to express and purify SmERK1, SmERK2 and SmJNK proteins to validate a protein activity assay based on th ATP binding site interrogation using fluorescence polarisation detection through the use of a probe, named BODIPY® FL ATP-γ-S. Alternatively, we also performed an in silico screening prioritizing compounds by compound docking to the ATP binding site of each S. mansoni’s PK and the corresponding human orthologs. Thus, the PKs were modeled and the docking was accomplished using compounds available on Managed Chemical Compound Collection (MCCC). Additionally, SmHGPRTases and SmPAI-RBP1 functional roles were characterized using RNA interference and protein activity quantification. In this work, we were able to express all the PKs and purify SmJNK and SmERK. We also developed a fluorescence polarization based assay to verify the binding capabilities of PKs to ATP and validated the screening as a high-throughput method using a set of small molecules predicted to dock into the ATP-binding site of PKA. Besides that, the prioritizing of compounds using in silico docking proved to be a very useful tool. From aproximatelly 80,000 compounds from the MCCC, 140 were selected, from those, 61 compounds were active: nine for SmERK1, one for SmERK2, twelve for Smp38, five for JNK and 36 for all PKs. Additionally, using predicted inhibitors for Smp38 and SmJNK, we also confirmed that Smp38 pathway regulates the SmHGPRTase 1, SmHGPRTase 3 and SmPAI-RBP1 and SmJNK pathway regulates SmPAI-RBP1. Our results also suggest that SmHGPRTases activity has an essential role in sporocyst and schistosomula development since significant differences in viability, size, and/or shape were observed after the knockdown in vitro. Also, the SmHGPRTase-knockdown in schistosomula influences the development of the ovary and egg maturation in female adult worms recovered from mammalian infection and promote movement alterations in the worms knocked-down in vitro. Moreover, SmPAI-RBP1 may be involved in sporocyst and schistosomula development, and may also be related to tegument damage in adult male worms in which the tubercles’ height were reduced. Concluding, this study provided useful tools to discover potential new drugs against PKs targets from S. mansoni and other organisms, identified a large number of potential hit compounds against Schistosoma, and contributed to elucidate the functional roles of essential genes for S. mansoni.CAPESFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, Brasil.pors.n.S. mansoniRNA de interferênciaProteína quinaseS. mansoniRNA interferenceKinase proteinSchistosoma mansoniRNA de interferênciaProteína quinaseCaracterização de genes regulados pelas vias das MAP quinases e triagem de inibidores para o desenvolvimento de novos fármacos contra o Schistosoma mansoniinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesis2020Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Belo Horizonte, MG, BrasilUniversidade Federal da Bahia. Salvador, BA, BrasilUniversidade Federal de Minas Gerais. Belo Horizonte, MG, BrasilBelo Horizonte, MG, BrasilFundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde. 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Schistosoma mansoni RNA de interferência Proteína quinase |
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Schistosoma mansoni utiliza sinais extracelulares específicos para gerar respostas celulares apropriadas para se desenvolver e sobreviver no corpo do seu hospedeiro. Nesse contexto, a transdução de sinal envolvendo proteínas quinases eucarióticas (ePKs) tem papéis essenciais em mecanismos reguladores. Recentemente, nosso grupo mostrou que as Proteínas Quinases Ativadas por Mitógenos (MAPKs), como SmERK1, SmERK2, Smp38 e SmJNK, estão envolvidas na reprodução/oviposição, sobrevivência e desenvolvimento do parasito, indicando que essas MAPKs podem ser alvos promissores para o desenvolvimento de novos fármacos para o tratamento da esquistossomose. Dados de RNASeq também demonstraram que as vias de Smp38 e SmJNK regulam a expressão de um grande conjunto de genes, dentre eles dois genes importantes para o ciclo de vida do parasito: (1) proteína de ligação ao RNAm do inibidor do ativador do plasminogênio 1 (SmPAI-RBP1), responsável pela estabilidade/regulação do PAI-1, que funciona como o principal inibidor do ativador do plasminogênio tecidual (tPA) e da uroquinase (uPA) e, portanto, da fibrinólise; e (2) hipoxantina-guanina fosforibosiltransferases (SmHGPRTases), uma família de enzimas chave (codificada por cinco genes diferentes) para via de salvação de purinas, uma vez que o parasito não tem a capacidade de realizar a síntese de novo de purinas. Dessa forma, este trabalho procurou identificar compostos ativos e específicos para as MAPKs de S. mansoni e caracterizar SmPAI-RBP1 e SmHGPRTases, pois esses dois genes poderiam ser alvos de drogas mais específicos contra a esquistossomose. Primeiramente, para verificar a atividade das PKs e, posteriormente, realizar a triagem de moléculas usando inibidores das mesmas, as proteínas SmERK1, SmERK2 e SmJNK foram expressas para validar um ensaio de atividade protéica com base na investigação do sítio de ligação ao ATP usando a detecção de polarização da fluorescência através do uso de uma sonda denominada BODIPY® FL ATP-γ-S. Como alternativa a este teste, também realizamos uma triagem in silico para priorização de moléculas disponíveis na Managed Chemical Compound Collection (MCCC) por “docking” para predizer ligações das moléculas ao sítio de ligação ao ATP de cada PK do S. mansoni e dos ortólogos correspondentes em humanos para posterior teste in vitro. Além disso, os papéis funcionais de SmHGPRTases e SmPAI-RBP1 foram caracterizados usando RNA de interferência e quantificação da atividade de proteínas. Neste trabalho, conseguimos expressar todas as PKs e purificar SmJNK e SmERK1. Também desenvolvemos um ensaio baseado em polarização de fluorescência da luz para verificar a capacidade de ligação das PKs ao ATP e validamos a triagem como um método “high-throughput” usando moléculas preditas em se ligar ao sítio de ligação ao ATP da PKA. Além disso, a priorização de compostos usando o “docking” in silico provou ser uma ferramenta muito útil. De 80.000 moléculas do MCCC, 140 foram selecionadas, dentre essas, 61 foram ativas, sendo nove para SmERK1, uma para SmERK2, doze para Smp38, cinco para JNK e 36 para todas as PKs. Além disso, usando inibidores preditos para Smp38 e SmJNK, confirmamos experimentalmente que a via Smp38 regula SmHGPRTase 1, SmHGPRTase 3 e SmPAI-RBP1 e a via SmJNK regula SmPAI-RBP1. Nossos resultados também sugerem que a atividade de SmHGPRTases tem um papel essencial no desenvolvimento de esporocistos e esquistossômulos, uma vez que diferenças significativas na viabilidade, tamanho e/ou forma foram observadas após silenciamento in vitro. Além disso, o silenciamento de SmHGPRTases influenciou o desenvolvimento do ovário e a maturação dos ovos em fêmeas recuperadas de infecções em mamíferos, promovendo também alterações de movimento nos vermes silenciados in vitro. Além disso, o SmPAI-RBP1 pode estar envolvido no desenvolvimento de esporocistos e esquistossômulos, e também pode estar relacionado a danos no tegumento em machos nos quais a altura dos tubérculos foi reduzida. Concluindo, este estudo forneceu ferramentas úteis para descoberta de possíveis novos fármacos tendo como alvos PKs de S. mansoni e de outros organismos identificando um grande número de moléculas ativas para diferentes estágios de vida do S. mansoni e também contribuiu para elucidar os papéis funcionais de genes essenciais para o ciclo de vida do S. mansoni. |
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BATISTA, Izabella Cristina Andrade. Caracterização de genes regulados pelas vias das MAP quinases e triagem de inibidores para o desenvolvimento de novos fármacos contra o Schistosoma mansoni. Belo Horizonte: s.n, 2020. 220 p. Tese(Doutorado em Ciências da Saúde. Área de Concentração: Biologia Celular e Molecular, Genética e Bioinformática)-Fundação Oswaldo Cruz. Instituto René Rachou. Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde. |
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