Obtenção de uma nova proteína quimérica para o uso em teste de diagnóstico sorológico da infecção pelo Trypanosoma cruzi

• Autor(a) principal: Durans, Andressa da Matta
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/30122
• topic: Doença de Chagas; Testes Sorológicos; Proteínas Quinases; Proteínas Mutantes Quiméricas

Doença de Chagas é uma doença negligenciada que ainda carece de um diagnóstico de alta eficácia, capaz de ser realizado em curto espaço de tempo, fácil manuseio e de baixo custo, para as regiões endêmicas. O desempenho dos testes sorológicos varia de acordo com a atividade e a qualidade da preparação de antígenos utilizados para a detecção de anticorpos anti-T. cruzi. Neste estudo foi apresentado uma abordagem inovadora em forma de uma proteína quimérica carreando epítopos de várias proteínas de T. cruzi que sirva de alvo em testes sorológicos, denominada de Plataforma Cruzi (PlatCruzi). Os epítopos B lineares inseridos na poliproteína foram selecionados de um conjunto de estruturas previamente identificadas experimentalmente, tanto em nosso laboratório quanto da literatura. A proteína quimérica foi construída contendo um cerne estrutural que permite a inserção de dez epítopos. Um gene foi gerado sinteticamente com oito epítopos inseridos, os outros dois epítopos foram inseridos por pareamento de oligonucleotídeos. O DNA sintetizado foi transferido para um vetor de expressão (pET-28a). A proteína quimérica resultante foi expressa em E. coli a elevados níveis em corpos de inclusão e purificadas até próximo da homogeneidade PlatCruzi mostrou alta reatividade contra soros de pacientes com doença de Chagas crônica (DChc) utilizados nas análises e sem reatividade na proteína sem inserção de epítopos. Os soros usados de pacientes infectados por Leishmania spp. não foram reativos com a PlatCruzi. Análises do desempenho individual dos epítopos de T. cruzi, inseridos na primeira plataforma, indicaram quatro epítopos que não apresentaram a reatividade esperada ao pool de soros de DChc, além disso, foi necessária modificação da posição de um epítopo, para o melhor reconhecimento do anticorpo IgG anti-T. cruzi. Esses resultados levaram a geração da variante PlatCruzi \03945, retirada do epítopo CRA (TcEp9) através do uso de enzimas de restrição, como também a criação da segunda versão da proteína quimérica, denominada de PlatCruzi V2, com mudanças estruturais e substituições de alguns epitpopos. Tanto a variante PlatCruzi \03945 quanto os resultados iniciais de PlatCruzi V2 não tiveram um melhor desempenho daquele apresentado por PlatCruzi, apontando a primeira versão da proteína quimérica com 100% de sensibilidade e especificidade nos ensaios imunoenzimáticos de ELISA. Em suma, os resultados sugerem que a engenharia da proteína quimérica poderá representar T. cruzi com sucesso em formatos de testes de diagnóstico rápidos e de ELISA que devem proporcionar uma elevada sensibilidade e especificidade para detectar indivíduos realmente infectados por T. cruzi