Cloning and optimization of induction conditions for mature PsaA (pneumococcal surface adhesin A) expression in Escherichia coli and recombinant protein stability during long-term storage

• Autor(a) principal: Larentis, Ariane Leites
• Data de Publicação: 2011
• Outros Autores: Argondizzo, Ana Paula Corrêa, Esteves, Gabriela dos Santos, Jessouron, Ellen, Galler, Ricardo, Medeiros, Marco Alberto
• Tipo de documento: Artigo
• Idioma: eng
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/34300
• topic: Expressão de PsaA recombinante; Design experimental; Projeto composto central; Purificação de troca iônica; Estabilidade de proteína; Armazenamento a longo prazo; Recombinant PsaA expression; Experimental design; Central composite design (CCD); Ion exchange purification; Protein stability; Long-term storage; Projetos de Pesquisa; Estabilidade Proteica

O gene correspondente à PsaA madura do serotipo 14 de Streptococcus pneumoniae foi clonado em um plasmídeo com resistência à canamicina e sem um marcador de purificação em Escherichia coli para expressar altos níveis da proteína recombinante para produção em larga escala como potencial candidato a vacina ou como transportador para conjugação de polissacarídeos em Bio-Manguinhos / Fiocruz. A avaliação das condições de indução (concentração de IPTG, temperatura e tempo) em E. coli foi realizada por técnicas de planejamento experimental para aumentar o nível de expressão de PsaA recombinante madura (rPsaA). A otimização das condições do processo de indução nos levou a realizar a indução da proteína recombinante a 25 ° C por 16 h, com 0,1 mM IPTG em meio de caldo Terrific. Nestas condições, o nível de expressão de rPsaA madura obtido em E. coli BL21 (DE3) Star por indução pET28a com IPTG estava na faixa de 0,8 g / L de meio de cultura, com uma concentração 10 vezes menor de indutor do que usualmente empregado , o que contribui para um processo menos dispendioso. O rPsaA maduro expresso em E. coli BL21 (DE3) Star representou aproximadamente 30-35% da proteína total. A purificao de rPsaA por troca iica permitiu a produo de protea recombinante de alta pureza sem etiquetas de fus. Os resultados apresentados neste trabalho confirmam que a proteína recombinante purificada mantém sua estabilidade e integridade por longos períodos de tempo em várias condições de armazenamento (temperaturas de 4 ou -70 ° C usando diferentes crioprotetores) e por pelo menos 3 anos a 4 ou −70 ° C em PBS. A conformação da proteína armazenada foi confirmada usando dicroísmo circular. A antigenicidade rPsaA madura foi comprovada pelo reconhecimento de soro de ratinho anti-rPsaA através de análise de western blot, e não foi detectada degradação de proteína após longos períodos de armazenamento.