Clonagem, expressão e análise do tráfego celular das proteínas prM/E do vírus da dengue sorotipo 3 fusionadas à proteína lisossomal LAMP

• Autor(a) principal: Guimarães, Georgia de Freitas
• Data de Publicação: 2009
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/61063
• topic: Dengue; Clonagem molecular; Otimização; Vacinas contra dengue; Dengue; Molecular cloning; Optimization; Dengue vaccines; Dengue; Clonación molecular; Mejoramiento; vacunas contra el dengue; Dengue; Clonage moléculaire; Optimisation; Vaccins contre la dengue

Diversas estratégias vacinais contra a dengue tem sido testadas, mas sem sucesso. A vacina de DNA é uma tecnologia recente, onde um ou mais plasmídeos recombinantes contendo o(s) gene(s) desejado(s) é inoculado. Porém uma das principais desvantagens das vacinas de DNA é a baixa imunogenicidade. A fusão do gene que codifica antígeno com o gene que codifica a proteína LAMP (Lysosome-Associated Membrane Protein), que direciona o antígeno para o lisossomo, resultam numa melhor resposta imunológica devido a apresentação dos antígenos aos linfócitos T helper CD4+ por moléculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe II (MHC II), gerando deste modo uma maior atividade proliferativa de linfócitos antígeno-específicos, altos títulos de anticorpos e intensa atividade T- citotóxica. É possível, também, otimizar os códons da sequência gênica do antígeno, resultando em uma maximização da expressão gênica e consequentemente uma melhor resposta imunológica. As proteínas pré-membrana e envelope do sorotipo 3 do vírus dengue foram clonadas no vetor p43HIVhumanLAMP/Gag, na forma selvagem e otimizada, resultando nos plasmídeos p43- DENV3-prM/E e p43-DENV3-prM/E-LAMP, p43-DENV3-prM/E-opt e p43-DENV3- prM/E-opt-LAMP. Neste estudo foram analisados a expressão e o tráfego das proteínas clonadas em células HEK-293. Foi possível observar a expressão das proteínas clonadas por imunofluorescência, mas não por Western-blot. Nos estudos de tráfego celular por microscopia confocal observou-se a localização lisossomal das proteínas prM/E fusionadas com a porção c-terminal de LAMP, e uma distribuição perinuclear das proteínas não fusionadas com LAMP. Os resultados obtidos neste projeto representam uma etapa inicial para o desenvolvimento futuro de uma vacina de DNA tetravalente contra o vírus da dengue.