An approach for quality control and characterization of protein conformers by using cross-linking mass spectrometry and pattern recognition

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Kurt, Louise Ulrich
Data de Publicação: 2020
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/44353
Resumo: O estudo de estruturas de proteínas e suas mudanças conformacionais, de acordo com o estado fisiológico da célula, é fundamental para avanços biotecnológicos como o desenvolvimento de novos fármacos. As metodologias de difração em raio-X e a de ressonância magnética nuclear (RMN), os padrões ouro para análises estruturais, apresentam várias limitações como: na técnica de raio-X, a necessidade de formação de um cristal que difrate com eficiência, o que nem sempre é possível; RMN sendo limitada a \201Cpequenos\201D complexos proteicos; e os dois métodos requerendo miligramas de proteína purificada, sendo as técnicas geralmente limitadas ao confôrmero mais abundante na solução. Para contornar esses problemas, a técnica de crosslinking químico associado a espectrometria de massas (XL-MS) emergiu como uma metodologia de alto potencial, utilizando a estabilização de sistemas proteicos usando agentes de cross-linking (chamados de cross-linkers) na geração de dados estruturais. Brevemente, o sistema proteico é digerido, um cross-linker é introduzido na mistura e os peptídeos ligados covalentemente podem ser identificados usando dados de espectrometria de massas no software SIM-XL, uma ferramenta de busca desenvolvida pelo nosso grupo. Recentemente, nós observamos a existência de muitos cross-links identificados com confiança que não satisfazem restrições espaciais de acordo com estruturas cristalográficas homólogas presentes na literatura. Nós levantamos a hipótese de que tais cross-links originam de outros confôrmeros presentes na mesma amostra. Neste trabalho desenvolvemos um método para ajudar na elucidação de diferentes estruturas de confôrmeros ao expor sistemas proteicos à diferentes condições biológicas, analisá-los por XL-MS, e fornecer um software capaz de fazer avalições de controle de qualidade do experimento e interpretar quantitativamente os dados gerados. Para alcançar esses objetivos, usamos a proteína HSP90 como um modelo de estudo sob quatro condições biológicas, e aplicamos um algoritmo de agrupamento não-supervisionado em resultados de cromatogramas de íon extraído (XIC) dos cross-links identificados para possibilitar a caracterização de diferentes confôrmeros.
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As metodologias de difração em raio-X e a de ressonância magnética nuclear (RMN), os padrões ouro para análises estruturais, apresentam várias limitações como: na técnica de raio-X, a necessidade de formação de um cristal que difrate com eficiência, o que nem sempre é possível; RMN sendo limitada a \201Cpequenos\201D complexos proteicos; e os dois métodos requerendo miligramas de proteína purificada, sendo as técnicas geralmente limitadas ao confôrmero mais abundante na solução. Para contornar esses problemas, a técnica de crosslinking químico associado a espectrometria de massas (XL-MS) emergiu como uma metodologia de alto potencial, utilizando a estabilização de sistemas proteicos usando agentes de cross-linking (chamados de cross-linkers) na geração de dados estruturais. Brevemente, o sistema proteico é digerido, um cross-linker é introduzido na mistura e os peptídeos ligados covalentemente podem ser identificados usando dados de espectrometria de massas no software SIM-XL, uma ferramenta de busca desenvolvida pelo nosso grupo. Recentemente, nós observamos a existência de muitos cross-links identificados com confiança que não satisfazem restrições espaciais de acordo com estruturas cristalográficas homólogas presentes na literatura. Nós levantamos a hipótese de que tais cross-links originam de outros confôrmeros presentes na mesma amostra. Neste trabalho desenvolvemos um método para ajudar na elucidação de diferentes estruturas de confôrmeros ao expor sistemas proteicos à diferentes condições biológicas, analisá-los por XL-MS, e fornecer um software capaz de fazer avalições de controle de qualidade do experimento e interpretar quantitativamente os dados gerados. Para alcançar esses objetivos, usamos a proteína HSP90 como um modelo de estudo sob quatro condições biológicas, e aplicamos um algoritmo de agrupamento não-supervisionado em resultados de cromatogramas de íon extraído (XIC) dos cross-links identificados para possibilitar a caracterização de diferentes confôrmeros.The study of protein structures and conformational changes, according to the cell’s physiological state, is fundamental to major biotechnological advances such as the development of pharmaceutical drugs. X-ray diffraction and nuclear magnetic resonance (NMR), the gold standards for structural analysis, present limitations such as: X-ray diffraction requiring the formation of a crystal, which is not always possible, and then requiring the crystal to efficiently diffract; NMR being limited to “small” protein complex; and both methods requiring milligrams of purified protein, and being usually limited to the most abundant conformer in the mixture. To overcome these issues, chemical cross-linking coupled with mass spectrometry (XL-MS) emerges as a prominent method for generating structural data by covalently stabilizing a protein system with cross-linkers. Subsequently, the system is digested, and the covalently linked peptides can be identified by mass spectrometry with SIM-XL, a tool developed by our group. We recently observed the existence of many cross-links not satisfying distance constraints according to crystal counterparts. We postulate these cross-links originate from other conformers in the same sample. Our goal was to provide a method that sheds light on different structures of conformers by referring to systems exposed to different biological conditions, analysing the contents with cross-linking mass spectrometry, and providing a software to enable the quality control and assessment of the dataset generated and interpretation of these experiments. To achieve this, we used the 90kDa heat shock protein (HSP90) as a study model under four biological conditions and relied on applying unsupervised clustering on extracted-ion chromatograms (XIC) of identified cross-linked peptides to enable characterization of the different conformers; we emphasize this approach is completely new.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Carlos Chagas. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.porConfôrmeroCross-LinkingIsomerismMass SpectrometryComputational BiologyEspectrometría de MasasBiología ComputacionalIsomérieSpectrométrie de masseBiologie informatiqueIsomerismoEspectrometria de MassasBioinformáticaBiologia ComputacionalAn approach for quality control and characterization of protein conformers by using cross-linking mass spectrometry and pattern recognitioninfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesis2020Instituto Carlos ChagasFundação Oswaldo CruzMestrado AcadêmicoCuritibaPrograma de Pós-Graduação em Biociências e Biotecnologiainfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZLICENSElicense.txttext/plain1748https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/44353/1/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD51ORIGINALLouiseKurt.pdfapplication/pdf6179974https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/44353/2/LouiseKurt.pdf67c47f267954f693a034e2f569bd91a4MD52TEXTLouiseKurt.pdf.txtLouiseKurt.pdf.txtExtracted texttext/plain129056https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/44353/3/LouiseKurt.pdf.txteb0947d24f305a8cd34c9c26f8a814f8MD53icict/443532022-01-10 12:04:32.873oai:www.arca.fiocruz.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352022-01-10T15:04:32Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false
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