Implementação da tecnologia de IgY para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina
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Data de Publicação: | 2012 |
Tipo de documento: | Tese |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) |
Texto Completo: | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/14353 |
Resumo: | Os métodos de diagnóstico sorológico são ainda as ferramentas mais realistas e aplicáveis para identificação de cães com leishmaniose visceral. A pesquisa por métodos sorológicos mais eficientes e de produção simplificada é importante para a identificação do reservatório canino, ação primordial para o controle da doença. Este estudo teve por objetivo o desenvolvimento e a avaliação do desempenho de um ELISA para leishmaniose visceral canina, utilizando como conjugado enzimático uma IgY antiIgG canina. Para isto, galinhas poedeiras foram imunizadas com IgG canina purificada e a IgY anti-IgG foi isolada das gemas dos ovos por precipitação com polietilenoglicol e purificada por meio de adsorção tiofílica. A especificidade frente ao antígeno imunizante foi verificada por imunodifusão radial dupla, ELISA e western-blot. O ELISA foi desenvolvido utilizando IgY conjugada a enzima peroxidase, tendo seus parâmetros de acurácia avaliados e comparados com o ELISA utilizando IgG de mamíferos conjugada a peroxidase. A concentração total de IgY isolada nas gemas foi constante, sem diferença significativa nos meses analisados (p>0,05), com média de 97,55 mg de IgY/ gema. A IgY produzida reconheceu a IgG canina, demonstrando uma forte sensibilidade e especificidade no ELISA, porém na imunodifusão não foi detectada ligação da IgY produzida a IgG canina. Após a imunização, houve um aumento significante da produção de IgY específica do primeiro para o segundo mês (p<0,05) onde ocorreu um pico estável sem queda de produção até o final do período analisado (p>0,05). A IgY demonstrou ainda, forte reatividade no western-Blot frente a IgG canina purificada e a presente no soro de cão clinicamente saudável, não sendo capaz de reconhecer IgG de outras espécies animais. A conjugação da IgY a enzima peroxidase ocorreu sem danos à sua estrutura, com discriminação entre as amostras positivas e negativas em todas as diluições do conjugado e concentrações do antígeno testadas. O ELISA utilizando IgY conjugada a peroxidase apresentou 100% de sensibilidade e 100 % de especificidade. A comparação dos parâmetros de acurácia do ELISA utilizando IgY com o ELISA utilizando IgG de mamíferos demonstraram valores idênticos. A repetibilidade do ensaio de ELISA IgY foi superior a encontrada com o ELISA IgG, com coeficiente de correlação intraclasse (ICC) estatisticamente significante (p<0,0001). Um maior agrupamento das amostras negativas e positivas, também verificada quando a correlação das duplicatas nas duas observações foram analisadas (p<0,0001). Diante de todos esses resultados a IgY ligada à peroxidase demonstrou ser um conjugado enzimático de excelente qualidade, revelando um melhor desempenho quando comparado ao conjugado produzido por mamíferos. |
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Santos, Fernanda NunesSilva, Valmir LaurentinoChaves, Sergio Augusto de Miranda2016-05-19T13:09:38Z2016-05-19T13:09:38Z2012SANTOS, Fernanda Nunes. Implementação da tecnologia de IgY para o diagnóstico da leishmaniose visceral canina. 2012. xvi,98 f. Tese (Doutorado em Saúde Pública) - Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2012.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/14353Os métodos de diagnóstico sorológico são ainda as ferramentas mais realistas e aplicáveis para identificação de cães com leishmaniose visceral. A pesquisa por métodos sorológicos mais eficientes e de produção simplificada é importante para a identificação do reservatório canino, ação primordial para o controle da doença. Este estudo teve por objetivo o desenvolvimento e a avaliação do desempenho de um ELISA para leishmaniose visceral canina, utilizando como conjugado enzimático uma IgY antiIgG canina. Para isto, galinhas poedeiras foram imunizadas com IgG canina purificada e a IgY anti-IgG foi isolada das gemas dos ovos por precipitação com polietilenoglicol e purificada por meio de adsorção tiofílica. A especificidade frente ao antígeno imunizante foi verificada por imunodifusão radial dupla, ELISA e western-blot. O ELISA foi desenvolvido utilizando IgY conjugada a enzima peroxidase, tendo seus parâmetros de acurácia avaliados e comparados com o ELISA utilizando IgG de mamíferos conjugada a peroxidase. A concentração total de IgY isolada nas gemas foi constante, sem diferença significativa nos meses analisados (p>0,05), com média de 97,55 mg de IgY/ gema. A IgY produzida reconheceu a IgG canina, demonstrando uma forte sensibilidade e especificidade no ELISA, porém na imunodifusão não foi detectada ligação da IgY produzida a IgG canina. Após a imunização, houve um aumento significante da produção de IgY específica do primeiro para o segundo mês (p<0,05) onde ocorreu um pico estável sem queda de produção até o final do período analisado (p>0,05). A IgY demonstrou ainda, forte reatividade no western-Blot frente a IgG canina purificada e a presente no soro de cão clinicamente saudável, não sendo capaz de reconhecer IgG de outras espécies animais. A conjugação da IgY a enzima peroxidase ocorreu sem danos à sua estrutura, com discriminação entre as amostras positivas e negativas em todas as diluições do conjugado e concentrações do antígeno testadas. O ELISA utilizando IgY conjugada a peroxidase apresentou 100% de sensibilidade e 100 % de especificidade. A comparação dos parâmetros de acurácia do ELISA utilizando IgY com o ELISA utilizando IgG de mamíferos demonstraram valores idênticos. A repetibilidade do ensaio de ELISA IgY foi superior a encontrada com o ELISA IgG, com coeficiente de correlação intraclasse (ICC) estatisticamente significante (p<0,0001). Um maior agrupamento das amostras negativas e positivas, também verificada quando a correlação das duplicatas nas duas observações foram analisadas (p<0,0001). Diante de todos esses resultados a IgY ligada à peroxidase demonstrou ser um conjugado enzimático de excelente qualidade, revelando um melhor desempenho quando comparado ao conjugado produzido por mamíferos.The serological diagnostic methods are still the most realistic and applicable tools for the identification of dogs with visceral leishmaniasis. The research for more efficient methods of simple execution for the identification of the canine reservoir is extremely important for disease control. The aim of this study was the development and performance evaluation of an ELISA assay for canine visceral leishmaniasis, using as enzyme conjugate an IgY anti-dog IgG. To this end, laying hens were immunized with purified dog IgG, and the IgY anti-IgG was isolated from the egg yolks by precipitation with polyethylene glycol and purified through thiophilic adsorption. The specificity against the immunizing antigen was assessed by double radial immunodifusion, ELISA and western-blot. The ELISA was developed using IgY conjugated to horseradish peroxidase enzyme, and the accuracy parameters were assessed and compared with ELISA using mammalian IgG conjugated to horseradish peroxidase. The total concentration of IgY isolated from the yolks was constant, no significant difference was detected over the months of duration of the study (p>0.05) and the mean was 97.55 mg IgY/ yolk. The IgY produced recognized dog IgG, showing a strong sensitivity and specificity in ELISA, but it was not detected in the double radial immunodifusion. After immunization, the production of specific IgY increased significantly from the first to the second month (p<0.05) and then a stable peak with no production decrease was observed until the end of the analyzed period (p>0.05). In the western-blot, IgY showed high reactivity against purified dog IgG and that present in the serum of clinically healthy dogs, and it was not able to recognize the IgG from other animal species. IgY was conjugated to horseradish peroxidase enzyme without any damage to its structure, distinguishing between positive and negative samples in all conjugate dilutions and antigen concentrations tested. The ELISA using IgY conjugated to horseradish peroxidase showed 100% sensitivity and 100 % specificity. The comparison of the accuracy parameters of ELISA using IgY and ELISA using mammalian IgG showed identical values. The repeatability of ELISA IgY was higher than that found with the ELISA IgG, with interclass correlation coefficient (ICC) was statistically significant (p<0,0001), a larger grouping of positive and negative samples that was also verified when the correlation of duplicates of both observations was analyzed (p<0.0001). Thus, IgY linked to horseradish peroxidase proved to be an excellent conjugate that showed better performance than the conjugate produced by mammals.Fundação Oswaldo Cruz. Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.porProdução de IgYLeishmaniose Visceral caninaELISAIgY ProductionCanine Visceral LeishmaniasisELISALeishmaniose Visceral/diagnósticoAnticorposImunoglobulinasBiotecnologiaImplementação da tecnologia de IgY para o diagnóstico da leishmaniose visceral caninaImplementation of IgY technology for the diagnosis of canine visceral leishmaniasisinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/doctoralThesisEscola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca, Fundação Oswaldo Cruz.Fundação Oswaldo Cruz, Escola Nacional de Saúde Pública Sergio Arouca.Rio de Janeiro/RJPrograma de Pós-Graduação em Saúde Públicainfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZORIGINALve_Fernanda_Santos_ENSP_2012.pdfapplication/pdf2881883https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/14353/1/ve_Fernanda_Santos_ENSP_2012.pdf041f28bbe2387bf591f544758b2bca29MD51LICENSElicense.txttext/plain1748https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/14353/2/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD52TEXT366.pdf.txt366.pdf.txtExtracted texttext/plain212264https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/14353/3/366.pdf.txt270fdf874ddc4ac5fcb568d408904d71MD53ve_Fernanda_Santos_ENSP_2012.pdf.txtve_Fernanda_Santos_ENSP_2012.pdf.txtExtracted texttext/plain213203https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/14353/4/ve_Fernanda_Santos_ENSP_2012.pdf.txta9f117945d077ba29764dcbbe2e4a86eMD54icict/143532023-01-19 14:06:16.263oai:www.arca.fiocruz.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352023-01-19T17:06:16Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false |
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