Desenvolvimento de controles de processo para a produção de conjugado de anticorpo anti-IgG canina com peroxidase de raiz forte utilizado no kit para detecção de leishmaniose canina

• Autor(a) principal: Mendes, Edinéa Pastro
• Data de Publicação: 2013
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/35997
• topic: Leishmaniose; Conjugado IgG-HRP; Ensaio imunoenzimático; Leishmaniosis; IgG-HRP Conjugated; Immunosorbent Assay; Leishmaniose; Cães; Imunoglobulina G; Técnicas Imunoenzimáticas; Kit de Reagentes para Diagnóstico

Leishmaniose é uma doença endêmica presente em mais de 80 países no mundo incluindo o Brasil, tornando-se um grave problema de saúde pública no mundo. A leishmaniose visceral (LV) causada pelo parasito Leishmania chagasi é uma doença que ocorre em seres humanos sendo cães um dos reservatórios do parasito. Dessa forma, o diagnóstico canino é essencial para os programas de vigilância da LV. No Brasil, o controle da LV é realizado pelo Ministério da Saúde, no qual preconiza a eutanásia de cães soropositivos, o controle do vetor, o diagnóstico precoce e o tratamento de casos humanos. No entanto, o impacto dessas medidas não tem surtido o efeito esperado na redução de casos humanos. Neste sentido, o correto diagnóstico é um importante passo para evitar a eutanásia desnecessária de cães e a transmissão da doença, pois assim evita-se que o cão infectado permaneça no ambiente como fonte de infecção. Bio-Manguinhos possui uma ampla linha de reativos para diagnóstico, dentre eles o Ensaio Imunoenzimático (Elisa) para diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina (EIE-LVC), o qual apresenta a possibilidade de diagnóstico em larga escala, melhor leitura e interpretação dos resultados quando comparado a outros testes sorológicos. Para competir com os demais produtos que atuam no mercado são necessários novos estudos que possam melhorar a eficiência e qualidade do kit (EIE-LVC). Nesta dissertação algumas estratégias foram estabelecidas e técnicas foram otimizadas para a produção de conjugados de anticorpos anti-IgG canina marcados com peroxidase (IgG-HRP) produzidos na Seção de Insumos, Conjugados e Apoio (SEICA)/Bio-Manguinhos. Neste estudo a obtenção da IgG foi realizada pelas etapas de precipitação com sulfato de amônio, dessalinização em cromatografia de exclusão e peneiração molecular (SEC) e purificação por cromatografia de troca aniônica em coluna Poros HQ. A imunoglobulina purificada foi analisada por SDS-PAGE, IEF-PAGE e quantificada pelo método de BCA. A conjugação da IgG purificada à HRP foi realizada através da metodologia de aminação redutiva, utilizando diferentes concentrações de metaperiodato de sódio e borohidreto de Sódio. Após a obtenção dos conjugados, estes foram avaliados quanto à conformação através de SEC, dicroísmo circular e espectrometria de fluorescência e caracterizados imunologicamente através de Elisa. A estabilidade dos conjugados foi avaliada através de curvas de desnaturação térmica e por testes de estabilidade acelerada. Os ensaios de monitoramento conformacional indicam que os conjugados apresentam uma grande estabilidade conformacional. Os ensaios de estabilidade acelerada ocorreram em três condições de temperatura a 4ºC, 37ºC e 50ºC, utilizando o estabilizante comercial Guardian™ em substituição ao estabilizante clássico do kit e placas preparadas para estocagem a 4ºC. A eficiência dos conjugados nestas condições foi avaliada por meio de Elisa frente a placas previamente sensibilizadas com antígeno de LV, contra soros positivos e negativos de painéis sorológicos padronizados utilizados no diagnóstico canino. Nossos dados de estabilidade acelerada indicam que os conjugados mantiveram a eficiência no reconhecimento dos anticorpos, mesmo em altas temperaturas, evidenciando que estes possuem estabilidade compatível para armazenamento a temperatura de 2ºC a 8ºC. Ao comparar os conjugados obtidos sob as novas condições com o conjugado clássico verificamos que ambos são capazes de distinguir as amostras positivas e negativas. Sendo assim, a implantação das novas estratégias demonstradas nesta dissertação podem ser utilizadas para aumentar a validade dos kits e facilitar o processo de produção.