Aprimoramento da técnica de redução do sal de tetrazol XTT aplicada ao controle da viabilidade da vacina BCG produzida no Brasil
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Data de Publicação: | 2011 |
Tipo de documento: | Trabalho de conclusão de curso |
Idioma: | por |
Título da fonte: | Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) |
Texto Completo: | https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/33590 |
Resumo: | A quantidade de bacilos viáveis presentes na vacina BCG é um importante requisito de qualidade deste produto, fazendo parte do controle exigido pela Coordenação Geral do Programa Nacional de Imunizações do Ministério da Saúde. Este controle objetiva avaliar a viabilidade dos bacilos no produto final, a estabilidade da vacina após stress térmico (termoestabilidade), além de permitir o monitoramento da consistência da produção. A contagem de colônias em meio sólido é o método oficial recomendado pela Organização Mundial da Saúde e pela Farmacopéia Brasileira para a determinação da viabilidade do BCG. A difícil dispersão do bacilo e seu crescimento lento conferem limitações ao método convencional, como a variabilidade dos resultados, a baixa reprodutibilidade e o prolongado tempo de análise. Este trabalho avaliou o método alternativo de redução do sal de tetrazol XTT modificado pelo uso de solução de cloreto de sódio 0,9% como diluente na determinação do número de viáveis em vacinas produzidas com BCG Moreau - RJ. O XTT é reduzido em formazana por ação enzimática das células metabolicamente ativas e a sua dosagem feita em leitor de ELISA. Por tratar-se de uma medida metabólica, a dosagem da formazana produzida proporcionalmente à respiração celular é um melhor indicador da viabilidade dos bacilos quando comparado aos métodos que dependem do cultivo e multiplicação celular. Foi demonstrada a redução do efeito background quando o uso do caldo Middlebrook 7H9 foi substituído por solução de cloreto de sódio 0,9% conferindo melhores ajustes lineares em 3, 24 e 48 horas e coeficiente de determinação (R2) de 0,99 em conformidade com a resolução Nº 899/2003 da ANVISA referente à validação de métodos bioanalíticos. A considerável redução do tempo de ensaio de 4 semanas para no máximo 48 horas, o relativo baixo custo, a facilidade de execução da técnica e os resultados obtidos são fortes incentivos à continuação dos estudos de validação e de correlação dos resultados de viabilidade do BCG fornecidos pela redução do XTT com àqueles obtidos pela técnica convencional de contagem de colônias em Lowenstein-Jensen. |
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Duarte, Eliana PereiraAlmeida, Antônio Eugenio Castro Cardoso deBranquinho, Maria ReginaRomão, Célia Maria Carvalho Pereira AraújoTonus, Maria Esther de Magalhães Machado, orient2019-06-19T16:54:59Z2019-06-19T16:54:59Z2011DUARTE, Eliana Pereira. Aprimoramento da técnica de redução do sal de tetrazol XTT aplicada ao controle da viabilidade da vacina BCG produzida no Brasil. 2011. 33 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Especialização em Controle da Qualidade de Produtos, Ambientes e Serviços Vinculados à Vigilância Sanitária) - Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde, Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, 2011.https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/33590A quantidade de bacilos viáveis presentes na vacina BCG é um importante requisito de qualidade deste produto, fazendo parte do controle exigido pela Coordenação Geral do Programa Nacional de Imunizações do Ministério da Saúde. Este controle objetiva avaliar a viabilidade dos bacilos no produto final, a estabilidade da vacina após stress térmico (termoestabilidade), além de permitir o monitoramento da consistência da produção. A contagem de colônias em meio sólido é o método oficial recomendado pela Organização Mundial da Saúde e pela Farmacopéia Brasileira para a determinação da viabilidade do BCG. A difícil dispersão do bacilo e seu crescimento lento conferem limitações ao método convencional, como a variabilidade dos resultados, a baixa reprodutibilidade e o prolongado tempo de análise. Este trabalho avaliou o método alternativo de redução do sal de tetrazol XTT modificado pelo uso de solução de cloreto de sódio 0,9% como diluente na determinação do número de viáveis em vacinas produzidas com BCG Moreau - RJ. O XTT é reduzido em formazana por ação enzimática das células metabolicamente ativas e a sua dosagem feita em leitor de ELISA. Por tratar-se de uma medida metabólica, a dosagem da formazana produzida proporcionalmente à respiração celular é um melhor indicador da viabilidade dos bacilos quando comparado aos métodos que dependem do cultivo e multiplicação celular. Foi demonstrada a redução do efeito background quando o uso do caldo Middlebrook 7H9 foi substituído por solução de cloreto de sódio 0,9% conferindo melhores ajustes lineares em 3, 24 e 48 horas e coeficiente de determinação (R2) de 0,99 em conformidade com a resolução Nº 899/2003 da ANVISA referente à validação de métodos bioanalíticos. A considerável redução do tempo de ensaio de 4 semanas para no máximo 48 horas, o relativo baixo custo, a facilidade de execução da técnica e os resultados obtidos são fortes incentivos à continuação dos estudos de validação e de correlação dos resultados de viabilidade do BCG fornecidos pela redução do XTT com àqueles obtidos pela técnica convencional de contagem de colônias em Lowenstein-Jensen.The quantity of bacilli present in BCG vaccine is an important quality requirement, as part of the control required by the Brazilian Ministry of Health. This control aims to evaluate the viability of the bacilli in the final product, the stability of the vaccine after thermal stress (thermal stability), and allows monitoring the consistency of production. The colony counting on solid medium is the official method recommended by the World Health Organization and by the Brazilian Pharmacopoeia. The hard spreadind of the bacillus and its slow growth are considered limitations to the conventional method, such as variability, low reproducibility and time consuming. The present work evaluated the alternative method of reduction of XTT salt of tetrazole modified by the use of using saline as diluent in determining the number of vaccines produced with viable BCG Moreau-RJ. XTT is reduced to formazan by enzymatic action of metabolically active cells and its measurement by ELISA reader. As a result of metabolic measurement, the quantity of formazan produced in proportion to cellular respiration is a better indicator of the viability of bacilli compared to methods depending on cultivation and cell multiplication. It has been demonstrated in our study the reduction of background effect when Middlebrook 7H9 broth was replaced by saline giving best linear fit after 3, 24 and 48 hours of incubation and coefficient of determination (R2 ) of 0.99 in accordance with Resolution No. 899/2003 ANVISA on the validation of bioanalytical methods. The reduction of length of assay from 4 weeks to 48 hours, the relative low cost, easiness of the technique and the results are strong incentives to further studies on validation and correlation of the results of viability of BCG provided by reducing the XTT with those obtained by conventional technique of counting colonies on Lowenstein-Jensen.Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Rio de Janeiro, RJ, Brasil.porVacinaBCGContagemColôniasVaccineBCGCoutingColonyVacina BCGContagem de Colônia MicrobianaMicrobiologiaAprimoramento da técnica de redução do sal de tetrazol XTT aplicada ao controle da viabilidade da vacina BCG produzida no Brasilinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/bachelorThesis2011-02-23Coordenação de Pós-GraduaçãoFundação Oswaldo Cruz. Instituto Nacional de Controle de Qualidade em SaúdeRio de Janeiro/RJCurso de Especialização em Controle da Qualidade de Produtos, Ambientes e Serviços Vinculados à Vigilância Sanitáriainfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)instname:Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)instacron:FIOCRUZORIGINAL29.pdfapplication/pdf624019https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/33590/1/29.pdf039edc1ce5ebea3ee10ecfac9afd5f9cMD51LICENSElicense.txttext/plain1748https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/33590/2/license.txt8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33MD52TEXT29.pdf.txt29.pdf.txtExtracted texttext/plain69394https://www.arca.fiocruz.br/bitstream/icict/33590/3/29.pdf.txt3d68127629bd129fbc8b563277b25047MD53icict/335902019-06-20 16:08:58.41oai:www.arca.fiocruz.br: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Repositório InstitucionalPUBhttps://www.arca.fiocruz.br/oai/requestrepositorio.arca@fiocruz.bropendoar:21352019-06-20T19:08:58Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA) - Fundação Oswaldo Cruz (FIOCRUZ)false |
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