Comparação de métodos moleculares aplicados ao complexo Candida parapsilosis

• Autor(a) principal: Barbedo, Leonardo Silva
• Data de Publicação: 2015
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/27911
• topic: Candida; Candidemia; Técnicas De Tipagem Micológica

Dentre as espécies de Candida não-albicans, Candida parapsilosis emergiu nas últimas décadas em todo o globo como relevante patógeno nosocomial em infecções fúngicas invasivas com disseminação hematogênica. Em alguns hospitais, C. parapsilosis tem se tornado a espécie predominante em candidemias, e a mais frequente em fungemias em adultos e recém-nascidos com o uso frequente de cateteres e nutrição parenteral. Desde 2005, baseado na técnica de tipagem por sequenciamento de multilocus (MLST), C. parapsilosis é considerado um complexo de leveduras formado por três diferentes espécies, onde C. parapsilosis lato sensu inclui as espécies Candida parapsilosis stricto sensu, Candida orthopsilosis e Candida metapsilosis. Até o presente, só é possível distinguir essas três espécies por técnicas de biologia molecular. Com isso, o objetivo deste trabalho foi comparar o sequenciamento da região D1/D2 da sub-unidade maior 28S do gene do DNA ribossomal (rDNA), com a PCR utilizando primers espécie-específios, a PCR-RFLP da região ITS1-5.8S-ITS2 e a análise de microsatélites (CP1, CP4a, CP6 e B), com a finalidade de se estabelecer uma identificação correta dos isolados de C. parapsilosis lato sensu. Um total de 100 isolados, oriundos de amostras de sangue e cateter, obtidos de pacientes de três hospitais no município do Rio de Janeiro, entre 1998 e 2006, associados a episódios de fungemia, foram analisados. O sequenciamento da região D1/D2 revelou 61 isolados de C. parapsilosis stricto sensu, 37 de C. orthopsilosis e 2 de C. metapsilosis. A PCR espécie-específica e a PCRRFLP mostraram 59 isolados de C. parapsilosis stricto sensu, 39 de C. orthopsilosis e 2 de C. metapsilosis A técnica de tipagem pelos microsatélites revelou 58 isolados de C. parapsilosis stricto sensu que amplificaram para os quatro marcadores, enquanto que três isolados não amplificaram apenas para o marcador CP4a, mas foram considerados como C. parapsilosis stricto sensu por amplificarem para os marcadores CP1, CP6 e B. Assim, o coeficiente Kappa entre a PCR espécie-específica ou a PCR-RFLP com o sequenciamento da região D1/D2 foi de 0,96; enquanto que o coeficiente para a metodologia dos microsatélites com o sequenciamento da região D1/D2, para os isolados de C. parapsilosis stricto sensu, encontramos Kappa = 1. Em dois pacientes identificamos C. parapsilosis stricto sensu oriunda do cateter e C. orthopsilosis oriunda do sangue, porém ambas coletadas no mesmo dia, assim, revelando infecção polifúngica. A metodologia dos microsatélites identificou 39 genótipos em multilocus, mostrando que nos 61 isolados de C. parapsilosis stricto sensu havia estirpes idênticas, diferentes e casos de microvariação. Nos casos de estirpes idênticas, encontramos duas situações: (i) isolados provenientes do mesmo paciente coletados com menos de três meses de diferença, sugerindo uma manutenção da estirpe e; (ii) isolados coletados tanto da amostra de sangue quanto de cateter do mesmo paciente, na mesma data, demonstrando que o cateter poderia ser a provável origem da infecção sistêmica. Já nos casos de presença de estirpes distintas, isoladas de um mesmo paciente, coletadas com mais de três meses de diferença, sugere uma substituição da estirpe Por fim, nos casos de microvariação, encontramos em isolados do mesmo paciente coletados no mesmo momento, em ambas amostras (sangue e cateter) pontuando de maneira contundente, pela robustez da metodologia empregada (microsatélites), microevolução em tais isolados. Este estudo reforça a importância da correta identificação de espécies, dos cuidados na manipulação do cateter, e da constante vigilância e monitoramento do ambiente hospitalar para identificar possíveis permanências de estirpes e suas rotas de transmissão