Cisteína proteinase B de Leishmania (Viannia) braziliensiscaracterização bioquímica e modulação da expressão durante a diferenciação in vitro

• Autor(a) principal: Gomes, Cinthia Bernardes
• Data de Publicação: 2017
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da FIOCRUZ (ARCA)
• Texto Completo: https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/20713
• topic: Leishmania braziliensis; Cisteína Proteases; Catepsina L; Butanos; Cetonas

A Leishmania (Viannia) braziliensis possui um mecanismo adaptativo auxiliado pelas cisteina proteinases B (CPB), uma enzima similar à catepsina L. O foco deste trabalho é estudar a expressão das isoformas dos genes da cpb (LbrM.08.0810, LbrM.08.0820 and LbrM.08.0830) e a atividade enzimática da CPB durante a diferenciação do parasito, induzida pelo choque de pH e temperatura. Tendo como base a sequência a 3\2019UTR dos genes cpb, avaliou-se os níveis de expressão relativa do gene LbrM.08.0810 que revelou uma maior quantidade de transcritos na fase logarítmica dos promastigotas em relação à fase estacionária (> 1.5 x). A expressão dos genes cpb diminuíram durante o choque em pH ácido e após o choque de temperatura, o qual foi seguido por um aumento desta expressão nos demais pontos analisados (> 1,3 x). Os genes LbrM.08.0820 LbrM.08.0830 mostraram perfis de expressão semelhante ao gene LbrM.08.0810, mas em menores níveis. Adicionalmente, a variação dos níveis de cisteína proteinases foram analisadas apartir da flutuação da atividade proteolítica (baseado no substrato Z- Phe-Arg-7-amino-4-metilcoumarina) em amostras de proteína das culturas submetidas a transformação in vitro Os resultados obtidos mostraram um aumento gradual da atividade enzimática para cada ponto do processo de diferenciação, em relação aos níveis de proteólise em amostras de promastigotas de fase logarítmica (3,1 ± 0,30 mmol min-1.mg proteína-1) a um pico de atividade após 72 horas de incubação a 32 °C (± 4,2 0,30 mmol min-1.mg proteína-1), seguido por uma diminuição aguda após 96 horas de incubação a 32 °C (2,8 ± 0,30 nmol min1.mg protein1). As atividades foram inibidas por Z-Phe- Phe-Fluorometil Cetona e trans-epoxisuccinil-L-leucilamida (4-guanidino) butano, provando se tratar de cisteína proteinases semelhantes à catepsina - L. Utilizando ensaios de ressonância de plasma de superfície, foi possível demonstrar que a enzima recombinante rCPB LbrM.08.0810 é capaz de se ligar à E-64, a pH 5,0 e pH 7,0 com as melhores constantes de equilíbrio. Coletivamente estes resultados indicam pela primeira vez a modulação da expressão e a potencial atividade biológica de catepsina-L símile durante a diferenciação in vitro de L. (V.) braziliensis induzida pelo choque de pH ácido e pelo aumento de temperatura. O conjunto de resultados obtidos nesse trabalho indica que as cisteína proteinases atuam nas etapas de diferenciação da L. (V.) braziliensis