Estudo do perfil protéico nas membranas de espermatozóides.

• Autor(a) principal: SANTOS, D. O.
• Data de Publicação: 2005
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da EMBRAPA (Repository Open Access to Scientific Information from EMBRAPA - Alice)
• Texto Completo: http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/530485
• topic: Eletroforese bidimensional; Bidimensional electrophoresis; Caprino; Reprodução animal; Inseminação artificial; Espermatozóide; Proteína; Goats; Artificial insemination; Reproduction; Spermatozoa; Proteins

Resumo: O presente estudo identificou o pertll protéico da membrana plasmática dos espermatozóides, congelados, de caprinos, através de eletroforese bidimensional (2-D). O objetivo foi encontrar proteínas que possam ser utilizadas como marcadores de congelabilidade na seleção precoce de doadores de sêmen. Para isso, foram utilizados seis machos caprinos, da raça Anglo-nubiana, de propriedade da Embrapa Caprinos, mantidos em regime de estabulação. O sêmen foi colhido, em vagina artificial, durante três épocas de inseminação artificial (EIA 1 - época seca; II - época chuvosa-seca; III - época seca-chuvosa), nos anos de 2002, 2003 e 2004, e avaliado a fresco, quanto ao volume (mL), a concentração (x 109 spz/mL), motilidade progressiva individual (MIP-f, %), o vigor (0 a 5) e a morfologia (% de defeitos maiores, DMa-f; menores, Dme-f e totais, DT -t). Logo após, foi submetido a congelação, em palhetas de 0,5 mL numa concentração de 150 x 106 espermatozóides por palheta, de acordo com o protocolo do Laboratório de Andrologia, Tecnologia de Sêmen e Inseminação Artificial da Embrapa Caprinos. Em seguida foi armazenado em nitrogênio líquido até seu uso na inseminação artificial e analise de proteínas. Para avaliar a fertilidade do sêmen foram inseminadas 321 cabras, sem raça definida, manejadas em pastagem nativa, com escore corporal entre 2,5 e 4,0, distribuídas por reprodutor e EIA 's. As cabras foram inseminadas após estimulação do estro, através do "Efeito Macho", a partir do oitavo dia, pela via transcervical, entre 10 e 12 horas após a identificação do estro, quando o sêmen foi então descongelado. Os resultados das características espermáticas foram analisados pela analise de variância e as proteínas qualitativamente, registrando-se o peso molecular (kDa) e o ponto ísoelétrico (pl). O sêmen a fresco apresentou valores de MIP-f de 68,4 a 86,3%, vigor-f de 3,3 a 3,8 e DT -f de 10,6 a 19,5%. À descongelação, a MIP variou de 21,2 a 27,9%, o vigor de 1,7 a 2,0 e os DT de 12,6 a 17,6%, entre reprodutores. Houve diferença significativa (P<0,05) da MIP-f entre reprodutores e EIA's. A MIP-d não variou em função dos reprodutores e EIA' s, o mesmo sendo valido para o vigor e DT, tanto a fresco quanto à descongelação. Houve correlação positiva (P<0,05; r = 0,213) entre MIP-f e MIP-d e o vigor-f e vigor-d (P<0,05; r = 0,250). A fertilidade do sêmen congelado, avaliada pela taxa de prenhez variou entre 7,4 e 19,0%, sem diferença significativa (P>0,05). Já entre as EIA's estas variaram (P<0,05), sendo observada a mais baixa na III EIA. A dosagem das proteínas totais (PT) da membrana plasmática dos espermatozóides de cada palheta (0,5 mL) foi conduzida no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceara, em Fortaleza, através do método colorimétrico, por espectrofotometria, tendo a albumina sérica bovina como padrão. Os valores da PT variaram de 38,3 a 59,0m/0,5 mL, entre reprodutores e de 43,3 a 52,5m/0,5 mL entre EIA's. O perfil protéico, obtido da analise das membranas plasmáticas dos espermatozóides por 2-D, revelou a presença de proteínas de peso molecular de 5,7 a 65,4 kDa e pl de 4,6 a 8,7. Foram observados vários isõmeros. As proteínas de baixo peso molecular, peptídeos, de 5,7 e 6,4 kDa somente foram observadas em alguns dos reprodutores e ElA' s. Conclui-se que, foram identificadas proteínas de membrana plasmática dos espermatozóides de caprinos, tanto de baixo quanto de alto peso molecular, porém são necessários o aprofundamento e prosseguimento deste estudo, a fim de avaliar a eventual associação destas proteínas com as características espermáticas e a congelabilidade do sêmen dos reprodutores estudados. Abstract - The study identified the goat frozen sperm plasmatic membrane proteins profile, using bidimensional electrophoresis (2-D). The aim was to detect those proteins that eventually could be used as markers to select the males by fertility. To evaluate the fertility rates six Anglo-nubian goat male belonging to Embrapa Caprinos kept in stable was used. The sperm was collected by artificial vagina during three insemination seasons (EIA; I, dry season; II, rains-dry season; III, dry-rains season) and the years 2002, 2003 and 2004. The ejaculated sperm was evaluated by volume (mL), concentration (x109 spz/mL), individual progressive motility (MIP-f, %) and vigor-f (0 to 5), and morphology (% of major, DMa-f; minor Dme-f and total, DT-f, abnormalities). There after the sperm was frozen according to Laboratório de Andrologia, Tecnologia de Sêmen e Inseminação Artificial da Embrapa Caprinos, in 0.5 mL straw, with a concentration of 150 x 106 spz/straw and stored in liquid nitrogen. These frozen sperm was maintained until insemination and protein analysis. To evaluate the fertility rate, 321 crossbreed goats, raised on native pasture, with body score between 2.5 and 4.0, were inseminated. Males and EIA's divided the goats in groups. The goats were inseminates after estrus stimulation (male effect) on eighth day after 10 to 12 hours of estrus identification. At insemination the sperm was towed and its characteristics evaluated. The sperm parameters were analyzed by variance analysis and the proteins qualified by molecular weight (kDa) and isoelectric point (pI). The ejaculated sperm showed values of MIP-f ranging from 68.4 to 86.3%, vigor-f 3.3 to 3.8 and DT-f 10.6 to 19.5%; the frozen values of MIP-d were 21.2 to 27.9%, vigor-d 1,7 to 2.0 and DT-d 12.6 to 17.6%. It was observed a significant variation (P<0.05) of MIP-f between the males and even EIA's. The same significance was not observed concerning MIP-d, vigor-f and d, and DT-f and d. A positive correlation was identified between MIP-f and d (P<0.05; r = 0.213) and vigor-f and d (P<0.05; r = 0.250). The male fertility rate validate by pregnancy rate varied from 7.4 to 19.0%, not significant. However, these rates were significant (P<0.05) between EIA's, the lower rate being observed during III EIA. The sperm plasmatic membrane total protein (PT) of each straw (0.05 mL) was determined at Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular da Universidade Federal do Ceará, in Fortaleza, using colorimetric method and bovine albumin serum as reference. Considering the males, PT values were 38.3 to 59.0 µg/0.5 mL and the EIA's 43.3 to 52.5 µg/0.5 mL. The 2-D sperm plasmatic membrane protein profile varied from 5.7 to 65.4 kDa and pI of 4.6 to 8.7. Various isomers were observed. The low molecular weight proteins, peptides, of 5.7 and 6.4 kDa were found only in some males and EIA's. In conclusion, we identify goat sperm plasmatic membrane protein of low and high molecular weight through bidimensional eletroforesis. However, to evaluate the possible association of those proteins with the sperm characteristics and freezing rate is necessary to continue and make a more profound study.