Avaliação in vitro da atividade antiviral de fitocomposto ao lentivírus caprino no sêmen e análise da coinfecção entre Mycoplasma agalactiae e o vírus da artrite encefalite Caprina (CAEV) no Ceará.

• Autor(a) principal: PEIXOTO, R. M.
• Data de Publicação: 2018
• Tipo de documento: Tese
• Idioma: por
• Título da fonte: Repositório Institucional da EMBRAPA (Repository Open Access to Scientific Information from EMBRAPA - Alice)
• Texto Completo: http://www.alice.cnptia.embrapa.br/alice/handle/doc/1099143
• topic: Mycoplasma agalactiae

Resumo: O lentivírus caprino apresenta-se disseminado no Brasil, propiciando a ocorrência de infecções secundárias, as quais são comuns em animais com enfermidade viral. Ademais, infecções por Mycoplasma agalactiae (M. agalactiae) são diagnosticadas em muitos estados nordestinos, os quais também se encontra presente o vírus da artrite encefalite caprina (CAEV), onde a inexistência de vacina ou tratamento eficaz propicia a eliminação de muitos reprodutores de alta qualidade genética dos rebanhos. Nesse contexto, há a necessidade de buscar métodos de evitar a disseminação do vírus pela via reprodutiva, e consequentemente evitar o estabelecimento de infecções simultâneas. Assim, objetivou-se determinar a ocorrência de coinfecção pelo lentivírus caprino e Mycoplasma agalactiae nos rebanhos leiteiros do Ceará, bem como avaliar in vitro a atividade antiviral de extratos etanólicos de Azadirachta indica A. Juss. (nim) contra esse lentivírus presente no sêmen caprino. Esse trabalho foi dividido em três etapas. Na 1ª etapa investigou-se a existência de anticorpos antiMycoplasma agalactiae em rebanhos leiteiros no estado do Ceará e a sua possível correlação com a artrite encefalite caprina (CAE). Utilizaram-se 417 fêmeas e 69 reprodutores caprinos (486 animais) de raças com aptidão leiteira, puros ou mestiços, de sistema intensivo ou semiintensivo, advindos de quatro mesorregiões do estado do Ceará. Anticorpos contra o CAEV foram detectados pela microtécnica de imunodifusão em gel de ágar (IDGA) e de Western Blot (WB). Já os anticorpos anti-Mycoplasma agalactiae optou-se pelo kit comercial de imunoensaio enzimático da IDEXX Laboratories?. A soroprevalência de M. agalactiae em rebanhos de caprinos leiteiros no Ceará foi de 0,62% (3/486). Não evidenciou correlação entre os resultados obtidos no ELISA para M. agalactiae e CAEV por IDGA ou por WB (p<0,05). Na 2ª etapa, buscou-se determinar a concentração ideal de dimetilsulfóxido (DMSO) a ser usado na dissolução dos extratos etanólicos. Pool de sêmen de cinco caprinos foi diluído em meio essencial mínimo (MEM) enriquecido com glicose a 0,01M, acrescido de concentrações de DMSO (0; 1,5; 1,75; 2,0; 2,25 e 2,5%). Os tratamentos foram refrigerados a 7°C e avaliados até quatro horas após adição de DMSO. Mensurou-se motilidade individual progressiva (MIP), vigor espermático (V), porcentagem de espermatozoides reativos ao teste hiposmótico (HO) e morfologicamente normais (NOR). MIP, vigor e NOR permaneceram dentro dos padrões normais para caprinos em todos os tratamentos. Com isso não foi evidenciado interferência do DMSO nos parâmetros analisados, quando adicionado a uma concentração máxima de 2,5% ao diluidor MEM, sem interferir na qualidade do sêmen caprino refrigerado. Por fim na 3ª etapa, avaliou-se o efeito dos extratos etanólicos de Azadirachta indica ao sêmen caprino, e seu potencial de inativar o CAEV no mesmo. Para tanto, pool de sêmen de quatro reprodutores caprinos foi diluído em MEM enriquecido com glicose a 0,01M e das frações testes (extrato bruto, acetato de etila e etanol) previamente dissolvidas em DMSO em duas concentrações (75µg/mL e 150µg/mL) e seus parâmetros espermáticos (MIP, V, NOR) avaliados a cada duas horas pós-adição dos extratos até um período máximo de quatro horas. Em seguida, um novo pool de sêmen foi infectado com cepa CAEV Cork e tratado com as respectivas frações testes (extrato bruto, acetato de etila e etanol) por 30, 60 e 90 minutos, em duas concentrações (75µg/mL e 150µg/mL) para então ser cocultivado com células de membrana nictitante ovina (MNO) durante 63 dias, com realização de Nested PCR do DNA pró-viral do sobrenadante coletado a cada sete dias e da respectiva passagem celular, e RT-nPCR do sobrenadante coletado na semana seguinte póspassagem. Todos os parâmetros espermáticos permaneceram dentro da normalidade para espécie caprina em todos os tratamentos, e sem apresentar diferença estatística (p>0,05) entre os mesmos. O extrato Azadirachta indica em Acetato de Etila e Etanol na concentração de 150µg/mL teve ação antiviral contra o lentivírus, no entanto, novos ensaios devem ser realizados para poder validá-lo. Como conclusão geral, essa pesquisa demonstrou que não foi verificada a existência de correlação positiva na incidência de infecção pelo CAEV e pelo M. agalactiae no presente estudo no estado do Ceará, e que em virtude da disseminação da CAE pelo estado que os extratos etanólicos de Azadirachta indica dependendo da concentração e fração, há potencial de inibir o lentivírus caprino no sêmen, podendo ser uma ferramenta válida no controle do vírus pela via reprodutiva. Abstract: The caprine lentivirus is disseminated throughout Brazil causing the occurrence of secondary infections, which are common in animals with viral disease. In addition, infections by Mycoplasma agalactiae (M. agalactiae) are frequently diagnosed in several states of the Northeastern region of Brazil, in which the caprine arthritis encephalitis virus (CAEV) is also found very often. In these locations, the lack of vaccine or effective treatment forces the elimination of many breeders that have elevated genetic value from the flocks. In this context, there is a necessity of seeking methods to avoid virus transmission through reproduction and consequently prevent simultaneous infections. Hence, this study aimed to determine the occurrence of coinfection by the caprine lentivirus and Mycoplasma agalactiae in dairy flocks of Ceará. In addition, the antiviral activity of ethanol extracts of Azadirachta indica A. Juss. (nim) against this lentivirus was evaluated in the caprine semen. This study was divided in three steps. First, the presence of anti-Mycoplasma agalactiae antibodies was assessed in dairy flocks in Ceará state and the possible correlation between these cases and the caprine arthritis encephalitis (CAE). A total of 417 female and 69 male caprine breeders (486 animals) with milk production aptitude were used in this study. These animals were pure or mix breed and reared in intensive or semi-intensive systems distributed in four mesoregions of Ceará state. CAEV antibodies were detected with micro technique of agar gel immunodiffusion (AGID) and Western Blot (WB). The presence of anti-Mycoplasma agalactiae antibodies was assessed with an enzymatic commercial kit of IDEXX Laboratories?. Seroprevalence of M. agalactiae in dairy caprine flocks in Ceará was 0.62% (3/486). There was no correlation between the results obtained from ELISA to M. agalactiae and CAEV using AGID or WB (p0.05). The ethyl acetate and ethanol extracts of Azadirachta indica in the concentration of 150µg/mL presented antiviral effect against the lentivirus. However, new studies must be performed to validate these results. As a general conclusion, this study demonstrated that there is no positive correlation between the incidence of CAEV and M. agalactiae in Ceará state. In addition, considering the dissemination of CAE in this state, the ethanol extracts of Azadirachta indica, depending on the fraction and concentration, may present a potential inhibition effect against the caprine lentivirus in semen, which may be a valid tool for controlling the virus in reproduction.