Influ??ncia do hospedeiro (CHO) e da estrat??gia de cultivo nas estruturas glic??dicas e propriedades moleculares da tireotrofina humana

• Autor(a) principal: OLIVEIRA, JOAO E. de
• Data de Publicação: 2007
• Tipo de documento: Tese
• Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
• Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/11590
• topic: tsh; trh; purification; ion exchange chromatography; high-performance liquid chromatography; cho cells; carbohydrates; bioassay; in vivo

Neste trabalho foi desenvolvida pela primeira vez uma estrat??gia de purifica????o com duas etapas, uma cromatografia de troca i??nica e uma cromatografia l??quida de alta efici??ncia em fase-reversa (RP-HPLC), para obter um hTSH derivado de CHO (r-hTSH-IPEN), que mostrou-se r??pida e pr??tica, permitindo um rendimento de 70% e uma pureza > 99%. Um aumento de ~60% na produtividade de r-hTSH-IPEN foi observado quando condi????es de cultura celular foram alteradas de 5% de CO2 para ar (0,03% CO2). A qualidade dos produtos obtidos em ambas as condi????es foi avaliada com rela????o ?? estrutura dos N-glicanos, aos is??meros de carga e ?? atividade biol??gica em compara????o com a ??nica prepara????o comercial conhecida (Thyrogen??) e com uma prepara????o de refer??ncia de origem hipofis??ria (p-hTSH) do National Hormone and Pituitary Program (NIDDK, EUA). Os N-glicanos identificados nas prepara????es recombinantes foram do tipo complexo, apresentando estruturas bi-, tri- e tetra- anten??rias, algumas fucosiladas, sendo 86-88% sialiladas com n??veis vari??veis. As tr??s estruturas mais abundantes foram monosialiladas, representando ~69% de todas as formas identificadas nas tr??s prepara????es. A principal diferen??a foi encontrada em termos de antenaridade, com 8-10% mais estruturas bi-anten??rias na aus??ncia de CO2 e 7-9% mais estruturas tri-anten??rias na presen??a de CO2. No caso do p-hTSH foram identificadas estruturas do tipo complexo, com alta-manose e h??bridas, a maioria delas contendo res??duos terminais de ??cido si??lico e/ou sulfato. As duas estruturas mais abundantes contem um ou dois res??duos de sulfato, sendo que no primeiro caso ele inesperadamente se liga a uma galactose. A porcentagem de liga????o do ??cido si??lico ?? galactose nas conforma????es 2-3 e 2-6 foi de 68 ?? 10% e 32 ?? 10% respectivamente. N??o foram observadas diferen??as fundamentais nos is??meros de carga, nas tr??s prepara????es recombinantes, os perfis da focaliza????o isoel??trica mostrando seis bandas distintas no intervalo de pI de 5,39 a 7,35. Uma distribui????o consideravelmente diferente, com v??rias formas na regi??o ??cida, foi observada, no entanto, para duas prepara????es hipofis??rias. Uma bioatividade ligeiramente superior (p <0,02) foi encontrada para o r-hTSH-IPEN obtido na presen??a de CO2 quando as prepara????es foram analisadas com boa precis??o por um simples bioensaio em dose ??nica; esta atividade, no entanto, n??o ?? significativamente diferente da atividade do Thyrogen, as duas prepara????es sendo 1,6 e 1,8 vezes mais potentes do que a prepara????o de refer??ncia (p-hTSH). Podemos concluir que, pelo menos para o caso dos r-hTSH derivados de CHO, diferentes condi????es de cultivo n??o afetam significativamente as estruturas dos N-glicanos, distribui????o de is??meros de carga ou atividade biol??gica. Thyrogen e r-hTSH-IPEN, quando comparados com p-hTSH-NIDDK, apresentaram cerca de 7% de aumento da massa molecular determinada por MALDI-TOF-MS. Esta t??cnica, que permite uma avalia????o exata da massa do heterod??mero, apresentou valores de MR de 29611, 29839 e 27829, respectivamente. Diferen??as significativas foram encontradas entre o r-hTSH e o p-hTSH pelo que se refere ??s propriedades hidrof??bicas, avaliadas por RP-HPLC. Tamb??m foram observadas diferen??as relacionadas ?? composi????o de carboidratos, principalmente de ??cido si??lico e galactose, tendo sido encontrado um menor teor destes res??duos no p-hTSH.