Utilizacao de celulas CHO cultivadas na presenca de cicloheximida para obtencao e caracterizacao de prolactina humana glicosilada (G-hPRL) recombinante

• Autor(a) principal: HELLER, SUSANA da R.
• Data de Publicação: 2008
• Tipo de documento: Dissertação
• Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
• Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/11738
• topic: lth; purification; recombinant dna; cho cells; cycloheximide

A Prolactina humana hPRL ?? um horm??nio prot??ico com 199 amino??cidos (MM ~ 23.000 Da) com um amplo espectro de atividades biol??gicas, sendo mais conhecido por estimular a lacta????o e regular o crescimento e diferencia????o da gl??ndula mam??ria. Al??m de quebra proteol??tica, a maioria dos variantes de prolactina podem ser resultantes de outros processos p??s-traducionais como polimeriza????o, fosforila????o, desamida????o, sulfata????o e glicosila????o. Essa prote??na cont??m apenas um s??tio potencial de glicosila????o por liga????o ?? asparagina, localizada no amino??cido 31, que ?? parcialmente ocupado (10%) quando a prote??na ?? sintetizada em c??lulas eucariotas. Apesar da atividade biol??gica in vitro da prolactina glicosilada (G-hPRL) ser muito menor (~4 vezes) quando comparada ?? n??o glicosilada, sua fun????o fisiol??gica ainda n??o ?? bem definida e a por????o de carboidrato parece ter um importante papel na bioss??ntese, secre????o, atividade biol??gica, e clearance plasm??tico do horm??nio. Com o objetivo de melhor caracterizar e estudar esta variante hormonal, foi realizada sua purifica????o em escala laboratorial a partir de c??lulas de ov??rio de hamster chin??s (CHO) modificadas geneticamente, utilizando meio de cultura suplementado com cicloheximida, aumentando ~4 vezes sua concentra????o absoluta e ~10 vezes a raz??o entre a isoforma glicosilada e a n??o-glicosilada. A purifica????o da G-hPRL seguiu um processo simples e efetivo de duas etapas principais baseado em uma coluna de troca cati??nica e uma coluna preparativa de exclus??o molecular acoplada a um sistema de cromatografia l??quida de excus??o molecular de alta efici??ncia (HPSEC). A caracteriza????o foi feita por HPLC de fase reversa (RP-HPLC) e exclus??o molecular, SDS-PAGE, Western Blotting, espectometria de massa (MALDI-TOF) e um bioensaio in vitro utilizando c??lulas Nb2 e Ba/F3-LLP. Nossos resultados demostram que a cicloheximida pode ser uma importante ferramenta para aumentar a produ????o de prolactina glicosilada, facilitando a purifica????o e caracteriza????o dessa isoforma.