Isolamento e caracteriza????o da delta toxina do veneno de Crotalus durissus terrificus

• Autor(a) principal: CAMPOS, LUCELIA de A.
• Data de Publicação: 2006
• Tipo de documento: Dissertação
• Título da fonte: Repositório Institucional do IPEN
• Texto Completo: http://repositorio.ipen.br/handle/123456789/11452
• topic: toxins; venoms; snakes; blood coagulation factors; fibrinolysin

O veneno de C. d. terrificus tem sido descrito como sendo de pouca complexidade, tendo 4 fra????es caracterizadas, convulxina, giroxina. crotoxina e crotamina. O presente trabalho visou o isolamento e caracteriza????o da Delta toxina cuja exist??ncia havia sido aventada em trabalhos anteriores. Ap??s a realiza????o de uma varredura de tamp??es em uma coluna de exclus??o molecular Superdex-75 acoplada a um sistema FPLC, na presen??a de tr??s diferentes tamp??es, chegou-se a uma condi????o ideal de fracionamento do veneno crot??lico. Em seq????ncia realizou-se a segunda etapa de purifica????o em sistema HPLC em uma coluna C4, onde foi poss??vel identificar o pico de interesse. O pico puro passou por an??lises em MALDI-ToF sendo sua massa estimada em 14.074,92 Da, Quando analisado por eletroforese em gel de poiiacrilamida, a delta toxina apresentou massa molecular de cerca de 14 kDa e uma migra????o an??mala, Por eletroforese 2D, a prote??na apresentou car??ter ??cido, com pl entre 4 e 5 e massa molecular de aproximadamente 42 kDa, revelando \"spots\" muito semelhantes podendo ser isoformas com caracter??sticas de uma prote??na glicosiiada. Ap??s digest??o dos spots com tripsina, os fragmentos foram confrontados com o banco de dados do \"swissprot\", mostrando alto grau de homologia \"at?? 43% de cobertura\" com a troca ri na, um ativador de protrombina do veneno de Tropidechis carinatus, esses dados foram confirmados com a an??lise de amino??cidos. De posse desses resultados, optou-se por testar a capacidade da fra????o purificada de ativar fator X e II, usando substratos sint??ticos. Os resultados apontaram para uma ativa????o direta do fator X, uma vez que n??o houve ativa????o do fator II, atividade que tamb??m n??o foi detectada no veneno total. A mesma se mostrou um potente ativador da agrega????o de forma direta, uma vez que os ensaios de agrega????o plaquet??ria foram realizados com plaquetas lavadas, logo na aus??ncia de fatores s??ricos. Quando os ensaios de agrega????o foram realizados na presen??a de alguns inibidores observou-se que nem a atividade metalo proteinase, nem a serino proteinase, tampouco um dom??nio lectina estavam envolvidos no processo, uma vez que EDTA, benzamidina e D-galactose n??o inibiram a atividade da prote??na. No presente trabalho isolamos a Delta toxina do veneno de C. d. terrificus. A mesma se comportou como previsto por Vital Brazil em 1980, eluindo na posi????o por ele aventada, sendo uma prote??na ativadora de Fator X que ativa agrega????o plaquet??ria mesmo em concentra????es muito baixas e de massa molecular de 40 kDa levando nos a crer se tratar de um homotr??mero cujos componentes s??o unidos por liga????es fracas.