Expressão e purificação de uma proteína multiepítopo recombinante desenhada a partir de proteínas do vírus da hepatite C

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Castro, Marielle de Oliveira
Data de Publicação: 2007
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_GOAIS (TEDE-PUC Goiás)
Texto Completo: http://localhost:8080/tede/handle/tede/3075
Resumo: A hepatite C é considerada um dos maiores problemas de saúde pública no mundo inteiro, inclusive no Brasil, pois uma vacina preventiva não está disponível, o número de infectados com a forma assintomática é elevado e para o controle da doença, há somente kits importados. Considerando, principalmente, o aumento da preocupação com a detecção precoce da hepatite C e que os métodos de diagnóstico desta infecção são de grande relevância clínica, o presente trabalho propõe a expressão e purificação de uma proteína codificada por um gene sintético (MEHCV Multiepítopo HCV). Para atingir este objetivo, uma proteína multiepítopo recombinante foi desenhada a partir de epítopos lineares, imunodominantes e filogeneticamente conservados do vírus da hepatite C (HCV), com a inclusão de seqüências imunodominantes dos genótipos mais prevalentes no Brasil (1a e 3a) e uma His-tag no C-terminal para facilitar a purificação da proteína recombinante expressa em bactéria. Estes epítopos (core, NS3, NS4A, NS4B e NS5) são considerados entre os mais importantes para o diagnóstico da doença e utilizados em muitos testes para detecção do HCV. O gene MEHCV (~720pb) possui sítios de restrição (NdeI e XhoI) nas suas extremidades que permitem a clonagem em fase no vetor de expressão bacteriano pET-21a. Para a síntese deste gene, foi feita a otimização para o códon usage de E. coli. A proteína de interesse (~29kDa) foi detectada por SDS-PAGE e Western blot. A purificação da proteína expressa foi realizada por cromatografia de afinidade em resina Ni-NTA. Como a purificação não foi total, foi feita uma nova purificação desta proteína por cromatografia de afinidade em coluna com resina Ni-NTA. No entanto, não houve esta purificação devido à presença de proteínas celulares. Sendo assim, na tentativa de alcançar a purificação total desta proteína multiepítopo, seria interessante a utilização de um novo protocolo, com a extração dos corpos de inclusão, onde todas as proteínas celulares solúveis seriam retiradas da solução.
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Para atingir este objetivo, uma proteína multiepítopo recombinante foi desenhada a partir de epítopos lineares, imunodominantes e filogeneticamente conservados do vírus da hepatite C (HCV), com a inclusão de seqüências imunodominantes dos genótipos mais prevalentes no Brasil (1a e 3a) e uma His-tag no C-terminal para facilitar a purificação da proteína recombinante expressa em bactéria. Estes epítopos (core, NS3, NS4A, NS4B e NS5) são considerados entre os mais importantes para o diagnóstico da doença e utilizados em muitos testes para detecção do HCV. O gene MEHCV (~720pb) possui sítios de restrição (NdeI e XhoI) nas suas extremidades que permitem a clonagem em fase no vetor de expressão bacteriano pET-21a. Para a síntese deste gene, foi feita a otimização para o códon usage de E. coli. A proteína de interesse (~29kDa) foi detectada por SDS-PAGE e Western blot. A purificação da proteína expressa foi realizada por cromatografia de afinidade em resina Ni-NTA. Como a purificação não foi total, foi feita uma nova purificação desta proteína por cromatografia de afinidade em coluna com resina Ni-NTA. No entanto, não houve esta purificação devido à presença de proteínas celulares. Sendo assim, na tentativa de alcançar a purificação total desta proteína multiepítopo, seria interessante a utilização de um novo protocolo, com a extração dos corpos de inclusão, onde todas as proteínas celulares solúveis seriam retiradas da solução.Hepatitis C is considered one of the largest problems of public health in the world, inclusively in Brazil, whereas a preventive vaccine none is available; the number of asymptomatic infections is elevated and for control of the disease, there exist only imported kits. Considering, principally, the increase of preoccupation with the detection of precocious hepatitis C and that the diagnostic methods of this infection are of the highest clinical importance, the presence study proposes the expression and the purification of one codified protein through a synthetic gene (MEHCV Multiepitope HCV). To achieve this objective, the new recombinant protein multiepitope was designed on the basis of epitopes linear, immunodominant and phylogenetically conserved from the virus of hepatitis C (HCV), including the immune dominating sequences of the genotypes that are more prevalent in Brazil (1a e 3a) and a His-tag in C-terminal to facilitate the purification of the recombinant protein express in bacteria. These epitopes (core, NS3, NS4A, NS4B e NS5) are considered among the most important for the diagnosis of the illness utilized for many HCV detection tests. The MEHCV gene (~720pb) possesses restrictive of sites (NdeI e XhoI) in yours extremities that permits the clonage in phase in the expression of vector bacterial pET-21a. To the synthesize of this gene was made the optimization to the codon usage of E. coli. The protein of interest (~29kDa) was detected by SDS-PAGE and Western blot. The purification of the protein express was realized by centrifugal in resin Ni-NTA by affinitive chromatography. Inasmuch as the purification was not total, a new purification was made of this protein by means of chromatography of affinity in column with resin Ni-NTA. However, did not having this purification owe a presence of cellular proteins. In such case, in the trial of obtain a total purification of this protein multiepitope, would be interesting the utilization of the one new protocol, with the extraction of the inclusion body, wherein all the dissolvable proteins cellular would be remove of the solution.Pontifícia Universidade Católica de GoiásCiências da SaúdeBRPUC GoiásCiências Ambientais e SaúdePfrimer, Irmtraut Araci Hoffmannhttp://buscatextual.cnpq.br/buscatextual/visualizacv.do?id=K4766376U6Torres, Fernando Araripe Gonçalveshttp://lattes.cnpq.br/8228010543041248Castro, Marielle de Oliveira2016-08-10T10:55:26Z2013-11-062007-03-23info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfCASTRO, Marielle de Oliveira. Expressão e purificação de uma proteína multiepítopo recombinante desenhada a partir de proteínas do vírus da hepatite C. 2007. 57 f. Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) - Pontifícia Universidade Católica de Goiás, Goiás, 2007.http://localhost:8080/tede/handle/tede/3075porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_GOAIS (TEDE-PUC Goiás)instname:Pontifícia Universidade Católica de Goiás (PUC-GO)instacron:PUC_GO2024-03-05T18:34:40Zoai:ambar:tede/3075Biblioteca Digital de Teses e Dissertaçõeshttp://tede2.pucgoias.edu.br:8080/http://tede2.pucgoias.edu.br:8080/oai/requesttede@pucgoias.edu.br||tede@pucgoias.edu.bropendoar:65932024-03-05T18:34:40Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_GOAIS (TEDE-PUC Goiás) - Pontifícia Universidade Católica de Goiás (PUC-GO)false
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