Produção da proteína recombinante estreptoquinase (Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis) em biorreator utilizando diferentes estratégias de batelada alimentada

• Autor(a) principal: Lunardi, Juleane
• Data de Publicação: 2011
• Tipo de documento: Dissertação
• Idioma: por
• Título da fonte: Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da PUC_RS
• Texto Completo: http://tede2.pucrs.br/tede2/handle/tede/5390
• topic: BIOLOGIA MOLECULAR; BIOLOGIA CELULAR; INFARTO AGUDO DO MIOCÁRDIO; TERAPIA TROMBOLÍTICA; FIBRINOLÍTICOS; PROTEÍNAS; BIOREATORES; CNPQ::CIENCIAS BIOLOGICAS::BIOLOGIA GERAL

A estreptoquinase (SK) é uma proteína extracelular produzida por uma variedade de linhagens de Streptococcus beta-hemolíticos, é uma proteína ativadora do plasmigênio composta de 414 aminoácidos com uma massa molecular de aproximadamente 47 kDa. A SK forma um complexo equimolar com o plasminogênio. Esse complexo resultante pode converter diretamente outra molécula de plasminogênio em plasmina, a protease ativa que degrada a fibrina presente nos coágulos sanguíneos. Esta enzima é hoje amplamente usada como agente trombolítico no tratamento do infarto agudo do miocárdio e outras desordens circulatórias. A baixa produtividade da estreptoquinase a partir das células de Streptococcus e a patogenicidade deste microorganismo são as principais razões para a exploração da tecnologia de DNA recombinante para produção desta importante proteína. Escherichia coli é o microorganismo mais comum utilizado para produção de proteínas heterólogas e o método de preferência para o aumento da concentração de proteínas recombinantes proporcional à densidade de células e produção de produtos específicos da célula, é a estratégia em bateladaalimentada. Sendo o Brasil totalmente dependente da importação de biofármacos, uma alternativa à estreptoquinase seria a produção desse biofármaco por meio de técnicas de DNA recombinante com experimentos de superexpressão e cultivo em biorreator, purificação e o ensaio de atividade da proteína estreptoquinase recombinante. Neste trabalho foram realizados cultivos de estreptoquinase de Streptococcus dysgalactiae subsp. equisimilis grupo C (SKC) em biorreator através de técnicas de batelada alimentada, testando diferentes meios de alimentação, estratégias de alimentação e tempos de indução com IPTG. Após definidas as melhores condições de cultivo a proteína recombinante foi purificada e sua forma homogênea foi utilizada para realização dos ensaios de atividade biológica. A máxima biomassa alcançada foi de 18,94 g/L em meio de cultura Luria - Bertani (LB) usando uma estratégia de alimentação linear na presença de glicose e MgSO4. Aproximadamente 21 mg de SKC homogênea foram obtidas a partir de 2 g de célula úmida usando um protocolo de purificação de três etapas com duas colunas cromatográficas. Quando comparada com o Padrão Internacional no ensaio colorimétrico, a atividade específica de SKC foi de aproximadamente 99%, mostrando que a SKC recombinante obteve uma atividade especifica muito similar ao padrão