Establishment of a suppression therapy for beta-thalassemia due to a nonsense mutation
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| Data de Publicação: | 2017 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10400.18/5112 |
Resumo: | Dissertação de mestrado em Bioquímica, especialização em Bioquímica Médica, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2017 |
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Establishment of a suppression therapy for beta-thalassemia due to a nonsense mutationβ-globinG418Nonsense-mediated DecayPremature Termination CodonPTC124β-globinaMecanismo de Degradação Mediado por Mutações nonsenseCodão Prematuros da TraduçãoExpressão GénicaGenómica Funcional e EstruturalDissertação de mestrado em Bioquímica, especialização em Bioquímica Médica, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa, 2017Orientadora Luísa Romão, Departamento de Genética Humana do INSA.Beta-thalassemia is a genetic disorder caused by the absence or reduction of human beta-globin protein levels, which causes a reduction on hemoglobin synthesis. This reduction can be caused by a premature termination codon (PTC) in the human beta-globin gene. The messenger ribonucleic acid (mRNA) containing a PTC can be recognized and degraded by the nonsense-mediated decay mechanism (NMD), if the PTC is located 50-54 nucleotides upstream of the last exon-exon junction. If the PTC is located near to the initiation codon (generally an AUG) or downstream of the last exon-exon junction, then this mRNA is not degraded by NMD. In the first case a small peptide is degraded by proteolysis and in the second case a long truncated protein is synthesised. These proteins aggregate and precipitate, leading to a severe damage of erythroid precursors. The conventional therapies for beta-thalassemia temporarily restore the levels of human beta-globin protein, however, these therapies have secondary effects that lead to the deterioration of the patient health. Given this, a therapy that could restore the levels of human beta-globin protein by inducing the readthrough of the PTC in human beta-globin gene, would be an advantage to these patients. Suppression therapy has been studied in detail for genetic diseases caused by PTCs. Salvatori et al. demonstrated the capability of G418 to induce the readthrough of a PTC at codon 39 of human beta-globin gene, however, the capability of suppression by this aminoglycoside at other codons of human beta-globin gene, and the use of other suppression compounds, have not yet been investigated. Suppression therapy consists in the readthrough of a nonsense codon into a sense codon, which allows the mRNA to be totally translated, resulting in a complete protein with partial or complete function. There are some compounds, including aminoglycosides and non-aminoglycosides, that bind to the decoding center of the ribosome and allow the near-cognate aminoacyl-tRNA binding, resuming translation. The main aims of this project were to understand if G418, an aminoglycoside, or PTC124, a non-aminoglycoside, produce efficient levels of readthrough of PTCs in human beta-globin mRNA, and to understand how different PTCs on beta-globin mRNA respond to the suppression therapy. Therefore, HeLa and HEK293 cells were transiently transfected with constructs containing the first 55 codons of human beta-globin gene fused to firefly luciferase gene (betaWT-FLUC, beta15-FLUC or beta39-FLUC). The results were obtained by Western blot and bioluminescence assays. The results obtained by Western blot seem to indicate that G418 induce the readthrough of PTCs at codon 15 or 39 of human beta-globin gene in HEK293 treated with concentrations higher than 400 microg/mL. Additionally, a PTC at codon 15 of human beta-globin gene seems to respond more efficiently to the readthrough than a PTC at codon 39. The results obtained for PTC124 are not conclusive, however, PTC124 might be inducing the readthrough of a PTC at codons 15 and 39 of human beta-globin gene in HEK293 cells treated with 5 microM, or 5, 10 and 15 microM of PTC124, respectively. Since G418 revealed to be able to restore the full-length human beta-globin protein in constructs containing a PTC at codon 15 and 39 of human beta-globin gene, it arises as a promising compound to be used in a future therapy for beta-thalassemia. Before that, it is important to study the effect of NMD in suppression therapy and how its inhibition can enhance the suppressive effect.A célula necessita de manter os níveis de proteína regulados, uma vez que estas possuem funções que determinam a sobrevivência e adaptação da célula em resposta a diferentes estímulos. De forma a regular estes níveis a célula altera os padrões de expressão génica, controlando vários processos celulares, nomeadamente, a transcrição e a tradução. Uma desregulação nestes processos pode levar a inúmeras doenças, como as doenças genéticas. A β-talassemia é um exemplo de uma doença genética, caraterizada pela redução ou ausência de β-globina, a qual leva consequentemente a anemia. A redução dos níveis de proteína pode ser causada pela presença de codões prematuros da tradução (PTCs) no seu mRNA. O mRNA que contenha estes PTCs pode ser envidado para o mecanismo de degradação mediado por mutações nonsense (NMD) caso cumpra os requisitos necessários. O NMD é um mecanismo de controlo de qualidade da célula, uma vez que tem um papel protetor contra erros genéticos. Durante o splicing são adicionados complexos exão-exão (EJCs) a 20-24 nucleótidos a montante das junções exão-exão. Durante a ronda pioneira da tradução todos os EJCs adicionados são removidos. No entanto, na presença de um PTC localizado a 50-54 nucleótidos a montante da junção exão-exão, o EJC não é removido e interage com outros complexos proteicos de forma a recrutar endonucleases e exonucleases, os quais levam à degradação do mRNA. Os mRNAs que contenham PTCs próximos do codão de iniciação são uma exceção a esta regra, assim como mRNAs que contenham PTCs a jusante da ultima junção exão-exão. Quando o mRNA que contenha o PTC não é enviado para NMD pode ocorrer a produção de pequenos péptidos, que são degradados por proteólise, ou de longas proteínas truncadas, que agregam e precipitam, levando à destruição dos percursores eritroides e ao agravamento do fenótipo do doente. Sendo assim, tanto o tipo de mutação com a sua posição no gene influenciam o fenótipo e a severidade da β-talassemia. Esta doença apresenta três fenótipos, a β-talassemia suave, a intermédia e a grave. Os pacientes que apresentam β-talassemia suave são assintomáticos, no entanto aqueles cujo fenótipo é mais grave, apresentam anemias severas com necessidade de transfusões sanguíneas recorrentes. A β-talassemia intermédia apresenta sintomas com grau de severidade entre a β-talassemia suave e β-talassemia grave. Apesar de não existir uma cura para a β-talassemia existem algumas terapias convencionais, como por exemplo, as transfusões sanguíneas que permitem restaurar temporariamente os níveis de β-globina no sangue. No entanto, estas terapias possuem efeitos secundários, nomeadamente a deposição de elevados níveis de ferro em diferentes órgãos e tecidos que prejudicam a saúde do doente. Desta forma, é importante estudar uma terapia que permita restaurar os níveis da proteína β-globina, assim como a sua função. Existem diversos artigos que relatam uma terapia de supressão onde são restaurados os níveis e a função de proteína em doenças causadas pela presença de um PTC, como na fibrose cística ou na distrofia muscular Duchenne. Esta terapia consiste na releitura de um codão que levaria à terminação prematura da tradução. Este processo permite que o mRNA seja totalmente traduzido, resultando na síntese de uma proteína completa e com pelo menos alguma da sua função restaurada. De forma a ser possível esta releitura, alguns compostos aminoglicósidos e não-aminoglicósidos permitem a ligação de um aminoacil-tRNA com duas bases compatíveis com o codão stop prematuro, anulando a ligação dos fatores de libertação da tradução ao PTC. Assim sendo, ocorre a incorporação de um novo aminoácido e a tradução continua. A terapia de supressão tem sido estudada em diversas doenças genéticas causadas pela presença de PTCs em genes, que levam à terminação prematura da tradução. Salvatori et al. demonstrou a capacidade do composto aminoglicósido G418 de induzir a releitura de um PTC no codão 39 no mRNA da β-globina humana. No entanto, a capacidade de supressão deste composto, assim como de outros agentes supressores, ainda não foi estudada na releitura de PTCs em outros locais do mRNA da β-globina humana. Assim, o objetivo principal deste projeto foi estudar que compostos aminoglicósidos e não-aminoglicósidos permitiam obter níveis eficientes de supressão de codões prematuros da tradução no mRNA da β-globina humana. Um segundo objetivo foi compreender como diferentes PTCs em diferentes posições do mRNA respondem a esta terapia de supressão. De forma a ser possível observar a proteína β-globina humana por Western blot, delineou-se uma estratégia que consistiu em clonar a open reading frame (ORF) do enhanced green fluorescent protein (EGFP), sem os codões de iniciação e terminação, no exão 3 do gene da β-globina. Apesar de inúmeras tentativas, não foi possível obter nenhum clone positivo. Dado que a estratégia anterior se mostrou difícil de alcançar, foi delineada uma segunda estratégia. Utilizaram-se construtos que continham 55 codões da β-globina humana em fusão com o gene da firefly luciferase. Estes construtos apesar de não sensíveis ao NMD por não conterem junções exão-exão, permitiram no entanto, compreender as características da terapia de supressão na releitura dos PTCs no mRNA da β-globina humana. De forma a alcançar os objetivos propostos, as células HeLa ou HEK293 foram transfectadas com os constructos referidos, sendo que o gene da β-globina não apresentava mutações (βWT-FLUC) ou possuía uma mutação nonsense no codão 15 (TGA) (β15-FLUC) ou 39 (TAG) (β39-FLUC). As células foram tratadas com G418 (aminoglicósido) ou PTC124 (não-aminoglicósido) e analisou-se a ocorrência de supressão por ensaios de bioluminescência e por Western blot. Após a análise dos resultados obtidos para as células HeLa transfectadas com constructos contendo um PTC no codão 39 no gene da β-globina humana, observou-se que o G418 levou ao aumento da atividade relativa da firefly luciferase na maioria das concentrações testadas. Os resultados obtidos para as células HEK293 aparentam indicar a presença de supressão de um PTC localizado no codão 15 ou 39 no mRNA da β-globina humana, quando estas células são tratadas com G418. No Western blot observou-se a presença de uma banda com tamanho similar à βWT-FLUC quando as células HEK293 transfetadas com construtos contendo um PTC localizado no codão 39 são tratadas com 500, 750, 1000 e 1250 μg/mL. Relativamente às células HEK293 transfetadas com constructos contendo uma mutação no codão 15 pudemos observar a presença de uma banda com tamanho similar ao βWT-FLUC para as células tratadas com G418 a 400, 500, 750, 1000 e 1250 μg/mL. Adicionalmente, foi observado um aumento da atividade relativa da firefly luciferase nestas condições. Este composto não parece influenciar a expressão do constructo βWT-FLUC em nenhuma concentração testada, em ambas as linhas celulares. Relativamente à eficiência de supressão, o composto G418 parece ser mais eficiente na releitura do PTC no codão 15 no mRNA da β-globina humana, relativamente à releitura do PTC no codão 39. Os resultados apresentados para o não-aminoglicósido PTC124 não são claros devido ao facto de as bandas presentes nos Western blots serem difusas. No entanto, é possível que o PTC124 induza a releitura do PTC no codão 15 do mRNA da β-globina humana, quando as células HEK293 são tratadas com PTC124 a 5 μM. Pareceu ser possível a releitura do PTC no codão 39 do mRNA da β-globina humana, quando as células HEK293 são tratadas com PTC124 a 5, 10 ou 15 μM. A eficiência da terapia de supressão pode ser influenciada pelo tripleto que compõe o codão prematuro da tradução ou pela sequência flanqueadora deste codão. Os resultados obtidos permitiram compreender que ambas as sequências flanqueadoras da mutação no codão 15 e no codão 39 permitem que ocorra a releitura do PTC, embora haja uma maior eficiência na releitura do PTC no codão 15 do mRNA da β-globina humana utilizando o composto G418. Apesar de estes resultados positivos indicarem um avanço para estabelecer uma terapia de supressão para a β-talassemia, existem várias vertentes desta terapia que ainda necessitam de ser exploradas. Dado que o NMD pode limitar os níveis de mRNA disponíveis para a releitura do codão, é importante testar a sua inibição (parcial) neste tipo de terapia, utilizando compostos que alteram a eficiência do NMD. Adicionalmente, é importante estudar a função da proteína sintetizada, dado que, após a reinserção de um novo aminácido, é possível que a sua função não seja completa.FCT/PTDC/BIMONC/4890/2014Romão, LuísaRepositório Científico do Instituto Nacional de SaúdeDias, Patrícia2017-11-292025-12-31T00:00:00Z2017-11-29T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.18/5112enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-20T15:40:40Zoai:repositorio.insa.pt:10400.18/5112Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T18:39:50.066344Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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