Estudo da potencial toxicidade do processo de silenciamento da ataxina 3 mutante humana mediado por shRNA lentiviral

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Codêsso, José Miguel Antunes
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10316/32499
Resumo: Dissertação de Mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.
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spelling Estudo da potencial toxicidade do processo de silenciamento da ataxina 3 mutante humana mediado por shRNA lentiviralshRNALentivírusDoença de Machado-Joseph (MJD)ToxicidadeNeurodegeneraçãoMicrogliaAstrócitosDissertação de Mestrado em Bioquímica, apresentada ao Departamento de Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra.Previamente, o nosso laboratório demonstrou a eficácia terapêutica do silenciamento génico da ataxina 3 mutante humana mediado por shRNA, usando lentivírus, no estriado e cerebelo de modelos animais da doença de Machado-Joseph (MJD). Tendo em conta as evidências crescentes de que o processo de silenciamento génico mediado por shRNAs pode conduzir a efeitos citotóxicos, decidiu-se averiguar a segurança da estratégia terapêutica anteriormente testada. Procedeu-se assim a uma avaliação da potencial toxicidade do shRNA lentiviral usado para o silenciamento da ataxina 3 mutante humana (shmutatx3), no estriado de murganhos. Com esse propósito foram analisados três aspectos: a integridade neuronal (através da análise imunohistoquímica da expressão de dois marcadores neuronais, DARPP-32 e NeuN, e da análise histoquímica com violeta de cresil), a resposta microglial (através da análise imunohistoquímica da expressão de um marcador microglial, iba-1) e a resposta astrocítica (através da análise imunohistoquímica e da análise por western blot da expressão de um marcador astrocítico, GFAP) no estriado de murganhos wild-type adultos em quatro time points após a injecção dos lentivírus: 2 semanas, 4 semanas, 8 semanas e 5 meses. O shmutatx3 parece apresentar toxicidade numa fase inicial, uma vez que os resultados referentes à avaliação da integridade neuronal indicam que a neurodegeneração às 2 semanas na injecção do LV-nlsLacZ-shmutatx3 (lentivírus que codificam o shmutatx3) é significativamente superior à que se verifica na injecção do LV-eGFP (lentivírus sem efeito terapêutico). Apesar da aparente toxicidade inicial, o shmutatx3 não é tóxico a longo prazo, uma vez que há uma recuperação funcional da zona lesada no estriado entre as 4 semanas e os 5 meses na injecção do LV-nlsLacZshmutatx3, que é quase completa aos 5 meses. Esse aspecto revela que existe uma adaptação neuronal à transcrição constitutiva do shmutatx3. Alguma da diferença em termos de neurodegeneração observada entre as injecções do LV-nlsLacZ-shmutatx3 e do LV-eGFP pode estar relacionada com o facto destes terem genes-repórter diferentes. Os resultados da avaliação da resposta microglial e da resposta astrocítica sugerem que a aparente toxicidade do shmutatx3 numa fase inicial, mas não a longo prazo, poderá derivar da prevalência alongada de uma microglia M1 e de um fenótipo pró-inflamatório dos astrócitos activados (fenótipos de defesa que podem ter um efeito neurotóxico se forem persistentes), que dá lugar à prevalência de uma microglia M2 e de um fenótipo anti-inflamatório dos astrócitos activados (fenótipos de reparação que têm um efeito neuroprotector e promotor do sprouting neuronal e da neurogénese) entre as 2 e as 4 semanas.Data from our laboratory has previously demonstrated the therapeutic efficacy of shRNA-mediated gene silencing of human mutant ataxin 3, using lentiviral vectors, in cerebellum and striatum of Machado-Joseph disease (MJD) animal models. Given the growing evidence that shRNAs-mediated gene silencing process can lead to cytotoxic effects, we decided to investigate the safety of our previously tested therapeutic strategy. Thus, in this study, we have evaluated the potential shRNA toxicity used for silencing human mutant ataxin 3 (shmutatx3), in the mouse striatum. For this purpose we analyzed three aspects: neuronal integrity (by immunohistochemical analysis of two neuronal markers, NeuN and DARPP-32, and histochemical analysis using cresyl violet), microglial response (by immunohistochemical analysis of a microglial marker, iba-1) and astrocytic response (by immunohistochemical analysis and western blot analysis of an astrocytic marker, GFAP) in the striatum of adult wild-type mice at four time points after injection of lentiviral vectors: 2 weeks, 4 weeks, 8 weeks and 5 months. The shmutatx3 seem to be toxic at an early-stage, since the results of neuronal integrity evaluation indicate that the neurodegeneration at 2 weeks in LV-nlsLacZshmutatx3 (lentiviruses encoding shmutatx3) injection is significantly higher than that found in LV-eGFP (lentiviruses without therapeutic effect) injection. Despite the apparent initial toxicity, shmutatx3 is non-toxic at long term, since there is a functional recovery of the injured area in the striatum between 4 weeks and 5 months in LVnlsLacZ-shmutatx3 injection, which is almost complete after 5 months. This aspect reveals that there is a neuronal adaptation to the constitutive transcription of shmutatx3. Some of the difference in the neurodegeneration observed between LVnlsLacZ-shmutatx3 and LV-eGFP injections may be related to the fact that these lentivirus have different reporter genes. The results of microglial response and astrocytic response suggest that the apparent toxicity of shmutatx3 at an early-stage, but not at long term, may derive from the elongated prevalence of a microglia M1 and a pro-inflammatory phenotype of activated astrocytes (defense phenotypes that may have a neurotoxic effect if they are persistent), which gives rise to the prevalence of a microglial M2 and an antiinflammatory phenotype of activated astrocytes (repair phenotypes that have a neuroprotective effect and promoting neuronal sprouting and neurogenesis) between 2 and 4 weeks.2015info:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesishttp://hdl.handle.net/10316/32499http://hdl.handle.net/10316/32499TID:201670917porCODÊSSO, José Miguel Antunes - Estudo da potencial toxicidade do processo de silenciamento da ataxina 3 mutante humana mediado por shRNA lentiviral . Coimbra : [s.n.], 2015. Dissertação de Mestrado em Bioquímica.Codêsso, José Miguel Antunesinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2022-01-20T17:49:55Zoai:estudogeral.uc.pt:10316/32499Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:57:08.470511Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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