Determinação da atividade de fatores de virulência em estirpes de Streptococcus pyogenes isoladas de diferentes tipos de infeção

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Esteves, Beatriz Gonçalves
Data de Publicação: 2023
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: por
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10451/59456
Resumo: Tese de mestrado, Microbiologia Clínica e Doenças Infeciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2022
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spelling Determinação da atividade de fatores de virulência em estirpes de Streptococcus pyogenes isoladas de diferentes tipos de infeçãoStreptococcus pyogenesNAD+ nucleosidaseEstreptolisina OEstreptolisina Semm89Tese de mestrado - 2022Domínio/Área Científica::Ciências MédicasTese de mestrado, Microbiologia Clínica e Doenças Infeciosas Emergentes, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2022Streptococcus pyogenes (Streptococcus do grupo A de Lancefield, GAS) é um dos agentes patogénicos mais comuns do ser humano, podendo causar faringoamigdalite, infeções superficiais da pele e tecidos moles e infeções invasivas. Em Portugal, estudos epidemiológicos prévios concluíram que a população de GAS possuía uma elevada diversidade genética, embora algumas linhagens estivessem significativamente sobre- ou sub-representadas em determinados tipos de infeção. Num conjunto de 68 estirpes representativo da diversidade genética e fenotípica de seis linhagens de interesse, pretendeu-se determinar a atividade de NAD-glicohidrolase (NADase), estreptolisina O (SLO) e estreptolisina S (SLS), para tentar identificar características genotípicas e fenotípicas relacionadas com a atividade destes fatores de virulência, que pudessem contribuir para a associação preferencial dessas linhagens com certos tipos de infeção. Como se pretendia determinar as atividades destes fatores de virulência a partir de sobrenadantes de culturas em fase exponencial tardia, foi necessário definir as curvas de crescimento das estirpes em estudo. De forma a simplificar o procedimento experimental de determinação de atividade, também se testou a possibilidade de realizar estes ensaios a partir de sobrenadantes de fase exponencial tardia previamente recolhidos e congelados a -80ºC. Como a congelação não interferiu com a atividade de NADase, SLO e SLS nos períodos de congelação testados (até seis meses de congelação), foi adotado este procedimento nos ensaios seguintes de determinação de atividade. Os ensaios de determinação de atividade foram executados com base em protocolos previamente utilizados no laboratório. No entanto, para confirmar que nas experiências de determinação da atividade de SLO e de SLS só estava a ser detetada a atividade do respetivo fator, sem interferência da outra estreptolisina, foi testada a atividade destes fatores na presença de colesterol (inibidor da SLO) ou de azul de tripano (inibidor da SLS), respetivamente. Foi possível concluir que a concentração de azul de tripano utilizada não era suficiente para inibir a atividade hemolítica de SLS, podendo assim existir alguma atividade hemolítica residual deste fator, nos ensaios de determinação da atividade de SLO. Apesar de se ter tentado otimizar a concentração deste reagente, no período de execução experimental desta dissertação, não foi possível concluir qual a concentração ideal a ser utilizada. Como tal, as atividades de SLO e SLS não foram determinadas para o conjunto completo de 68 estirpes, visto ser necessário terminar a otimização dos respetivos ensaios. No período de execução experimental desta dissertação, só foi possível concluir a determinação da atividade de NADase para o conjunto de estirpes pertencentes ao tipo emm89 (n=16). As atividades medidas estão de acordo com a literatura, corroborando uma maior atividade de NADase das estirpes pertencentes ao clade 3 (linhagem emm89-hasABC-), relativamente às dos clades 1 e 2 (linhagens emm89-hasABC+). No entanto, é importante realçar que a diferença observada entre níveis de atividade de linhagens distintas foi apenas de uma ordem de diluição. Como tal, poderão existir outros fatores a contribuir para o sucesso do clade 3 a nível mundial. Verificou-se também uma atividade de NADase superior nas estirpes com mutações no sistema de regulação CovRS, o que está de acordo com o facto deste sistema de regulação contribuir para a repressão do operão que codifica a NADase e a SLO. Deste modo, apesar de terem sido retiradas algumas conclusões quanto à atividade de NADase das estirpes do tipo emm89, para estabelecer correlações entre os níveis de atividade dos três fatores de virulência e características genéticas das estirpes ou tipos de infeção, será necessário determinar a atividade dos mesmos nas restantes linhagens genéticas, após otimização dos ensaios de atividade de SLO e SLS.Streptococcus pyogenes, also known as group A Streptococcus (GAS), is one of the most common human pathogens, being responsible for a wide range of clinical manifestations, such as pharyngitis, skin and soft tissue infections (SSTI) and invasive infections. In Portugal, previous epidemiological studies found that the GAS population was genetically diverse, although some clones were significantly over- or underrepresented in specific types of infection. The aim of this dissertation was to determine the NAD-glycohydrolase (NADase), streptolysin O (SLO) and streptolysin S (SLS) activities of 68 isolates, belonging to six clones of interest, to identify genotypic and phenotypic characteristics that could contribute to the preferential association of these clones with certain types of infection. Since the activities were measured from the supernatants of late exponential phase cultures, it was necessary to define the growth curves for each tested isolate. It was also tested whether the activity assays could be performed in previously collected supernatants, frozen at -80ºC. The results showed that supernatant freezing for up to 6 months did not interfere with the activities of NADase, SLO and SLS. Therefore, this proceeding was adopted in the subsequent assays. Activity assays were performed based on protocols previously used in the laboratory. However, to ascertain if the determination of SLO activity was not influenced by SLS, and vice versa, the activity of these virulence factors was analyzed in the presence of the respective inhibitor, namely cholesterol (SLO’s inhibitor) and trypan blue (SLS’s inhibitor). It was possible to conclude that the concentration of trypan blue used was not sufficient to completely inhibit the hemolytic activity of SLS, indicating that there may be some residual hemolytic activity of this factor in the measured SLO activity. Despite having tried to optimize the concentration of this reagent, during the experimental period of this dissertation it was not possible to conclude the ideal concentration to be used. As such, SLO and SLS activities were not measured for the remaining strains of interest. Due to time constraints, it was only possible to measure the NADase activity of isolates belonging to emm89 (n=16). The measured activities agree with the literature, supporting a higher NADase activity of strains belonging to clade 3 (emm89-hasABC-), in comparison to clades 1 and 2 (emm89-hasABC+). However, it is important to note that the difference observed between activity levels of isolates belonging to distinct lineages was of only one dilution factor. As such, there may be other factors contributing to the success of clade 3 worldwide. Higher NADase activity was also found in strains with mutations in the CovRS regulatory system, which agrees with the fact that this regulatory system contributes to the repression of the operon that encodes NADase and SLO. In order to establish correlations between the activity levels of the three virulence factors and genetic characteristics of the strains or types of infection, it will be necessary to quantify the activities in the remaining genetic lineages, after optimization of the SLO and SLS activity assays.Friães, Ana Isabel de AquinoRepositório da Universidade de LisboaEsteves, Beatriz Gonçalves2023-09-25T13:51:39Z2023-03-272023-03-27T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/59456TID:203265807porinfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T17:08:34Zoai:repositorio.ul.pt:10451/59456Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T22:09:22.068340Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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