Effects on migration of breast cancer cells in 3D models upon MMP inhibition
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| Data de Publicação: | 2016 |
| Tipo de documento: | Dissertação |
| Idioma: | eng |
| Título da fonte: | Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) |
| Texto Completo: | http://hdl.handle.net/10451/34369 |
Resumo: | Tese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016 |
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Effects on migration of breast cancer cells in 3D models upon MMP inhibition3D modelsBreast cancerCell migrationGelatinasesMMPs InhibitorsTeses de mestrado - 2016Ciências da SaúdeTese de mestrado, Ciências Biofarmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016Breast Cancer lethality is mostly due to metastization, an event that involves cells migration and invasion, with the latter being dependent of extracellular matrix degradation. Due to metalloproteinases (MMPs) role in migration and invasion and correlation of up-regulation of MMP-2 and 9 (gelatinases) with tumor aggressiveness, these enzymes are considered important druggable targets. 3D models, namely spheroids, have been described as more physiological relevant models. Therefore this work aimed to i) implement breast cancer spheroids model for migration studies; and ii) to evaluate the potential of two pyridine-containing macrocyclic compounds [15]pyN5 and [16]pyN5 as MMP inhibitors. The MMP-2 inhibitor ARP-100 was used as control. Spheroids of MDA-MB-231 cells were developed using MatrigelTM in non-adherent culture plates, being monolayer cultures used as controls. During the whole culture time, compact spheroids with diameters of ~200 μm were obtained, containing evenly distributed cells, with different gelatinase secretion when compared to monolayer cultures. The cytotoxicity of the compounds (1-100 μM) was evaluated, through a 24 h tetrazolium-based assay. Cell viability was > 70% for concentrations up to 50 μM of all compounds, in 2D and 3D cultures. The effect of these compounds (1-40 μM) on gelatinases activity was evaluated by a modified zymography technique. For 3D conditioned media both [15]pyN5 and [16]pyN5 at 7.5 μM revealed a 100% inhibition of MMP-2/9, while ARP inhibited 52% and 84% of MMP-9 and MMP-2 activity, respectively. Cell migration was analyzed through radial migration and scratch assay for 3D and 2D cultures, respectively. Migration in 2D models was affected (p<0.05) by both pyridine-containing macrocycles (5 μM), but not significantly by ARP-100 (up to 40 μM). Radial Migration was less extensively affected, having only significant inhibition for [16]pyN5 (20 μM) and ARP-100 (40 μM). In the future, invasion assays will be performed to further explore the therapeutic potential of these promising pyridine-containing macrocycles.O cancro de mama foi, em 2012, a 5ª causa de morte por cancro no mundo [1]. A maioria destas mortes deve-se à metastização, facto que se reflete na taxa de sobrevida a 5 anos que em cancros localizados é de 98,6% enquanto em cancro disseminado de mama é de 25,9% [2]. A metastização envolve migração e invasão celular, capacidades que as células tumorais de mama adquirem através da transição epitelial-mesenquimal. Esta transição consiste numa mudança de célula epitelial para uma célula do tipo mesenquimatosa e é caracterizada pela perda dos marcadores epiteliais, nomeadamente proteínas de interação célula-célula, célula-matriz extracelular (ECM), proteínas do citoesqueleto e perda de polarização. Simultaneamente, as células ganham a plasticidade necessária para a migração/invasão [3]. Este processo depende de proteases, entre as quais as metaloproteases de matriz (MMPs), grupo de enzimas dependentes de zinco que clivam elementos da matriz extracelular, entre outras funções [4]. As MMPs, especialmente o grupo das gelatinases (MMP-2 e 9), têm sido bastante associadas a tumores metastáticos e estão correlacionadas com a agressividade de alguns tumores [5]. Dado que as MMPs foram identificadas como possíveis alvos terapêuticos, foram desenvolvidos inibidores destas enzimas. Estes inibidores demonstraram resultados pré-clínicos promissores, mas já em fase clínica mostraram falta de eficácia e efeitos secundários de síndrome musculosquelético. Uma das hipóteses sugerida para este insucesso responsabilizava o grupo quelante de zinco comum a muitos destes inibidores, o ácido hidroxâmico [6]. No nosso laboratório foram sintetizados dois macrociclos do tipo pentaaza contendo um grupo piridina no anel, o [15]pyN5 e o [16]pyN5. Estes compostos têm a particularidade de apresentarem constantes de estabilidade elevadas para o catião Zn(II), tendo sido avaliado o seu potencial como inibidores de MMPs e consequentemente da migração celular. Por outro lado a elevada taxa de insucesso no desenvolvimento de fármacos na área de oncologia, revela a necessidade de ter modelos in vitro mais preditivos [7]. Os modelos celulares 3D vêm assim fazer uma ponte entre os modelos animais, mais complexos, e os modelos celulares 2D. Os modelos 3D são fisiologicamente mais relevantes do que os modelos de monocamada por simularem melhor as interações célula-célula, e na presença de ECM, as interações célula-matriz. Estes modelos são especialmente úteis no estudo de cancro dada a importância do microambiente tumoral para a progressão tumoral, incluindo a metastização [8]. Dos vários modelos 3D, os esferoides têm sido dos mais estudados. Estes modelos também são capazes de criar o gradiente de nutrientes e oxigénio que ocorre naturalmente in vivo, gradientes importantes para criar uma heterogeneidade de células proliferativas e por vezes até de centros necróticos [9]. iii Assim sendo, os objetivos deste trabalho foram utilizar a linha celular metastática de adenocarcinoma mamário, MDA-MB-231 para desenvolver modelos 3D. O modelo clássico 2D, foi utilizado como controlo. Nestes modelos testaram-se os compostos [15]pyN5 e [16]pyN5 como inibidores das MMPs, especificamente das gelatinases, e estudou-se o seu efeito na migração celular, comparativamente com um inibidor comercial da MMP-2, o ARP-100. O primeiro passo consistiu em implementar e optimizar os modelos 3D, utilizando placas de baixa aderência para a formação de agregados celulares. Por representar o melhor consenso entre esferoides morfologicamente homogéneos e razão célula/meio que permitisse o condicionamento de meio, escolheu-se um inóculo de 250.000 células/mL, obtendo-se esferoides com uma média de diâmetros de 200 μm. A caracterização de cortes histológicos dos esferoides do dia 4 de cultura, por hematoxilina & eosina, revelaram distribuição homogénea de células, a presença de ECM e ausência de centros necróticos. No entanto, a quantificação de proteína total, o ensaio de viabilidade por MTS e a imunomarcação com Ki-67 revelaram reduzida proliferação. O condicionamento de meio de culturas 2D e de esferóides e subsequente análise dos dois revelaram que os esferóides exibiam maior atividade da MMP-9 do que a MMP-2, contrariamente ao observado nas células em monocamada. A citotoxicidade dos compostos (1-100 μM) foi avaliada em ensaios de 24 horas com MTS, ensaio baseado na bioredução de um tetrazólio, de forma a selecionar as concentrações a serem usadas nos ensaios seguintes. A viabilidade para ambos os macrociclos contendo piridina revelou-se semelhante nos modelos 3D e nos 2D, não sendo inferior a 70% até 50 μM. Já para o ARP-100, a viabilidade celular no modelo 2D revelou-se mais baixa do que no modelo 3D, com concentrações acima de 50 μM. Seguidamente, o ensaio de zimografia de gelatina para análise da atividade das gelatinases foi implementado e otimizou-se o condicionamento de meio para a sua análise. A utilização de EDTA confirmou a natureza metalo-proteica das bandas observadas. Havendo a hipótese dos compostos se libertarem das gelatinases durante a eletroforese, fenómeno que ocorre com os inibidores endógenos das MMPs, modificou-se o ensaio de zimografia. A modificação consistiu em colocar os compostos ([15]pyN5 [16]pyN5 e ARP-100) em contacto com as gelatinases já após a eletroforese, na fase de degradação gelatinolítica. Desta forma garantiu-se que as diferenças observadas nas bandas resultavam do efeito direto dos compostos. O teste dos compostos demonstrou que o ARP-100 a 40 μM resultou numa inibição de 100%. No que respeita aos macrociclos, estes não inibiram a actividade gelatinolítica de meio condicionado das culturas 3D a 5 μM, mas atingiram notavelmente, 100% de inibição a iv 7,5 μM. Esta curva dose-resposta correlaciona com o zinco livre em condições fisiológicas, para ambos os compostos. O efeito dos compostos na migração celular em 2D foi testado com ensaios de ferida. Este ensaio consiste em fazer um risco numa monocamada confluente e medir a distância entre os extremos da ferida ao tempo 0, e neste caso, às 24 horas, o que indica a migração celular. Para os esferóides, fizeram-se ensaios de migração radial, colocando os esferóides sobre um revestimento de MatrigelTM, onde estes aderem. Após 24 horas mediram-se as distâncias entre as células migradas e a superfície dos esferóides. A migração no modelo 2D foi afetada com os compostos macrocíclicos contendo piridina a 5 μM: [16]pyN5 reduziu 38±2% e [15]pyN5 reduziu 21±4% da migração. No entanto, o efeito de inibição destes compostos não aumentou com a concentração. O ARP-100 pelo contrário, não demonstrou efeitos significativos de inibição até 40 μM. A migração dos modelos 3D revelou-se assim menos afectada pelos compostos. Os compostos macrocíclicos contendo piridina só demonstraram redução da migração aos 20 e 40 μM, só sendo significativa para o [16]pyN5 a 20 μM (20±4%). O ARP-100 apenas diminuiu 23±3% da migração celular a 40 μM (p<0.05). Concluindo, os modelos 3D de cancro de mama para o estudo de processos envolvidos na metastização, foram implementados e caracterizados com sucesso. Estes modelos demonstraram diferenças relativamente às células em monocamada. Aqui, reportámos também, que os dois compostos [15]pyN5 e [16]pyN5 reduziram a migração em monocamada e, de uma forma mais ligeira, a migração celular nos modelos 3D. Este efeito na migração envolve a inibição da atividade gelatinolítica da MMP-2 e MMP-9, e possivelmente das outras MMPs. Os dois macrociclos contendo piridina aparentaram ser mais potentes nestas funções relativamente ao ARP-100. Como perspetiva futura, pretende-se testar o [15]pyN5, o [16]pyN5 e o ARP-100 na invasão celular, dado o papel das MMPs ser ainda mais relevante neste processo. Também pretendemos investigar o mecanismo de inibição das MMPs com [15]pyN5 e [16]pyN5 através de estudos in silico.Miranda, Joana Paiva GomesOliveira, Nuno Guerreiro deRepositório da Universidade de LisboaProença, Susana Duarte Lopes Mascarenhas2019-04-01T00:30:14Z2016-06-092016-04-012016-06-09T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10451/34369TID:201487071enginfo:eu-repo/semantics/embargoedAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-11-08T16:29:38Zoai:repositorio.ul.pt:10451/34369Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T21:49:05.581198Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse |
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