Using induced pluripotent stem cells to investigate the mechanistic link between Gaucher disease and Parkinson related synucleinopathies

Detalhes bibliográficos
Autor(a) principal: Monteiro, Fábio Dantas Romero
Data de Publicação: 2015
Tipo de documento: Dissertação
Idioma: eng
Título da fonte: Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)
Texto Completo: http://hdl.handle.net/10400.1/8411
Resumo: Dissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015
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spelling Using induced pluripotent stem cells to investigate the mechanistic link between Gaucher disease and Parkinson related synucleinopathiesDoença de GaucherSinucleinopatiasMecanismoCélulas iPSDomínio/Área Científica::Engenharia e Tecnologia::Outras Engenharias e TecnologiasDissertação de Mestrado, Ciências Biomédicas, Departamento de Ciências Biomédicas e Medicina, Universidade do Algarve, 2015A doença de Gaucher é uma doença genética rara, autossómica recessiva, causada por mutações bialélicas do gene da glucocerebrosidase (GBA1), sendo a doença de depósito lisossomal mais comum. A glucocerebrosidase é uma enzima lisossomal, responsável pela degradação de glucocerebrosídeo em ceramida e glucose. Mutações homozigóticas ou heterozigóticas compostas no gene GBA1 provocam a disfunção da glucocerebrosidase, causando a acumulação de glucocerebrosídeo em diversos tipos celulares, especialmente em macrófagos visto que a maior parte de glucocerebrosídeo é derivado da fagocitose de leucócitos senescentes. Existe assim também, a acumulação de glucocerebrosídeo em diversos orgãos, especialmente no baço, fígado e medula óssea. A doença de Gaucher está divida em três subtipos, o tipo 1 ou a forma não-neuropática em que os sintomas mais comuns incluem hepatomegalia, esplenomegalia, trombocitopenia e anemia. Este é o tipo mais comum tendo uma frequência de 1 em cada 40000 pessoas sendo ainda mais comum nas populações judaicas asquenazes com uma frequência de 1 em cada 855 pessoas. Existe também o tipo 2 ou a forma neuropática aguda que é caraterizada por uma rápida neurodegeneração com envolvimento visceral e que normalmente leva à morte nos primeiros 2 anos de vida devido a problemas respiratórios. Finalmente existe o tipo 3 ou a forma neuropática crónica que embora seja varíavel, tipicamente se apresenta com manifestações neurológicas e viscerais, tal como o tipo 2, mas não de forma tão agravada. Ainda é desconhecido o mecanismo do envolvimento neurológico na doença de Gaucher tipo 2 e 3, no entanto poderá estar relacionado com defeitos da via autofágica-lisossomal, neuroinflamação e/ou a acumulação de glucocerebrosídeo, um glicolípido citotóxico, no cérebro. Relativamente ao tratamento, existem duas terapias disponíveis para tratar os sintomas viscerais da doença de Gaucher: a terapia de reposição enzimática que consiste em administrar sistemicamente glucocerebrosidase recombinante e a terapia de redução de substrato no qual há uma inibição da glucosilceramida sintase provocando a redução da síntese de glucocerebrosídeo de forma a compensar a reduzida degradação desta molécula. No entanto, estes tratamentos não são eficazes no tratamento dos sintomas neurológicos da doença de Gaucher devido à incapacidade do agente terapêutico transpor a barreira hematoencefálica. Embora existam sugestões de terapias alternativas capazes de ultrapassar este obstáculo, é necessário mais investigação de forma a consolidar estas terapias. Mutações no gene GBA1 é o mais preponderante factor de risco genético no desenvolvimento de sinucleinopatias relacionadas com Parkinson, nas quais existem um defeito no processamento da α-sinucleína e consequente acumulação, levando à formação de corpos e neurites de Lewy. Existem numerosos estudos experimentais, clínicos e genéticos associando pacientes e portadores da doença de Gaucher à doença de Parkinson e sinucleinopatias associadas a Parkinson. No entanto, o mecanismo desta associação permanece elusivo. Teorias propostas incluem: redução da atividade de glucocerebrosidase levando à ruptura do sistema autofagossomal e consequentemente à degradação reduzida de proteínas, levando assim ao aumento e acumulação de α-sinucleína ; redução de glucocerebrosidase levando à alteração da composição lipídica da membrana devido à acumulação de glucocerebrosídeo, afetando a função das jangadas lipídicas e portanto, a triagem e o transporte de proteínas relacionadas com as jangadas tais como a α-sinucleína ; redução de glucocerebrosidase levando ao sobrecarregamento da via de degradação do retículo endoplasmático e consequentemente, a sinais de stress do retículo endoplasmático e à acumulação de α-sinucleína ; entre outras. No presente estudo tentamos compreender melhor esta relação através do uso de células pluripotentes induzidas (iPSc ; induced Pluripotent Stem cells), uma técnica relativamente recente desenvolvida pelo laboratório de Shinya Yamanaka e que consiste na reprogramação de células diferenciadas de volta a um estado pluripotente, através de certos factores de trancrição (Oct4, Sox2, Klf4 e c-Myc). Shinya Yamanaka foi galadoardo com o Prémio Nobel de Fisiologia ou Medicina de 2012 devido a este feito. Esta técnica permitiu-nos obter células pluripotentes induzidas derivadas de fibroblastos provenientes de um doente de Gaucher, a linha celular GD FiPS 4F 21C, a qual diferenciámos para o destino neuronal de forma a analisar a relação entre a doença de Gaucher e sinucleinopatias associadas a Parkinson. A diferenciação neuronal foi feita através de dois métodos: formação de corpos embrióides e co-cultura com células estromais PA6 sob meio de cultura GMEM por 21 dias ; dissociação celular através da acção de accutase e cultura em placas revestidas com Matrigel sob o meio de cultura mTeSR™1, este método tendo sido acidentalmente descoberto pelo nosso laboratório e que pesquisa subsequente mostrou ser um comportamento específico da linha celular utilizada (GD FiPS 4F 21C). As culturas neuronais foram tratadas com chaperonas, moléculas que auxiliam o enovelamento de proteínas, neste caso da glucocerebrosidase mutante no retículo endoplasmático, de forma a aumentar a estabilidade, a atividade e o transporte para o lisossoma. As culturas neuronais foram também transduzidas com um vetor lentiviral que sobreexpressava glucocerebrosidase wild-type de forma a resgatar a atividade da glucocerebrosidase. Em ambos os casos o objectivo foi depois comparar os níveis de glucocerebrosidase e de α-sinucleína. No caso do tratamento com chaperonas, embora tenha havido variabilidade, as alterações dos níveis protéicos de glucocerebrosidase foram semelhantes às alterações dos níveis de α-sinucleína. No caso da sobreexpressão de glucocerebrosidase wild-type através de infecção lentiviral, não houve alterações significativas dos níveis de α-sinucleína. Estes resultados estão em contraste com numerosos estudos que argumentam um mecanismo de perda-de-função entre a glucocerebrosidase mutante e a α-sinucleína, isto é, a deficiência de glucocerebrosidase levando à disfunção lisossomal e à acumulação de α-sinucleína. No entanto, estes resultados estão de acordo com outros estudos que argumentam um mecanismo de ganho-de-função tóxico. É possível que o tratamento com chaperonas tenha ajudado na estabilização e transporte de glucocerebrosidase mutante para o lisossoma, onde teve um efeito direto ou indireto no aumento dos níveis de α-sinucleína. Esta hipótese explicaria também o porquê de não ter havido alterações nos níveis de α-sinucleína quando a glucocerebrosidase wild-type foi sobreexpressada. Estes resultados são no entanto, preliminares e mais pesquisa é necessária de forma a confirmar os nossos dados experimentais. Durante o decurso deste estudo estabelecemos também duas linhas celulares iPS, derivadas da GD FiPS 4F 21C e resgatadas relativamente aos níveis e atividade da glucocerebrosidase. Este desenvolvimento foi realizado através da dissociação celular de colónias, infecção lentiviral sobreexpressando glucocerebrosidase wild-type e cultura em fibroblastos mitoticamente inactivados. Foram obtidos 17 clones em que através da caracterização por PCR, western blot e ensaios de atividade enzimática, restaram 2 clones que possuíam altos níveis de glucocerebrosidase com altos níveis de atividade enzimática. Estas linhas celulares serão ferramentas importantes na continuação da investigação do mecanismo de ligação entre a doença de Gaucher e sinucleinopatias associadas a Parkinson.Tiscornia, GustavoSapientiaMonteiro, Fábio Dantas Romero2016-06-14T15:20:56Z2016-03-1020152016-03-10T00:00:00Zinfo:eu-repo/semantics/publishedVersioninfo:eu-repo/semantics/masterThesisapplication/pdfhttp://hdl.handle.net/10400.1/8411TID:201951100enginfo:eu-repo/semantics/openAccessreponame:Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos)instname:Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãoinstacron:RCAAP2023-07-24T10:19:40Zoai:sapientia.ualg.pt:10400.1/8411Portal AgregadorONGhttps://www.rcaap.pt/oai/openaireopendoar:71602024-03-19T20:00:35.233198Repositório Científico de Acesso Aberto de Portugal (Repositórios Cientìficos) - Agência para a Sociedade do Conhecimento (UMIC) - FCT - Sociedade da Informaçãofalse
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